输血医学实践技能教学初步探讨

<正>随着全球对安全使用血液的关注,对专业输血人员的需求越来越多。美国医院现在开展的输血医学相关服务项目包括:输血临床指导、临床供血、输血,机采治疗,细胞治疗,组织治疗。且每个医院都需有临床输血医师指导。目前,我国输血从业者现状是工作人员组成主要为输血技术人员,血     

基于二代测序的RhD阳性个体RHD基因mRNA选择性剪接分析

本研究旨在对RhD阳性个体中红细胞特异性表达的RHD基因不同转录本进行分析,并对选择性剪接发生的机制进行初步探讨。     

羊布鲁杆菌外膜蛋白19(OMP19)的表达及鉴定

目的构建可表达羊布鲁杆菌外膜蛋白19(OMP19)的真核表达载体,研究OMP19对宿主细胞凋亡的作用。方法以羊布鲁杆菌M5-90疫苗株基因组为模板,PCR扩增脂化型外膜蛋白19(L-OMP19)与非脂化型外膜蛋白19(U-OMP19)基因,产物连接至p Zero Back/blunt载体;经双酶切鉴定、测序正确的基因亚克隆到用于包装慢病毒的表达载体p HAGE-CMV-MCS-IZsGreen上,双酶切鉴定,构建含正确L-OMP19、U-OMP19基因的真核表达载体p HAGE-L-OMP19与p HAGE-U-OMP19。分别将构建好的载体转染293FT细胞、Huh7.5.1细胞和JEG-3细胞,用Western blot法及免疫荧光技术检测L-OMP19、U-OMP19蛋白的表达,用藻红蛋白标记的膜联素Ⅴ/7-氨基放线菌素D(annexinⅤ-PE/7-AAD)双染色结合流式细胞术检测细胞凋亡情况。结果构建能在细胞内表达L-OMP19和U-OMP19基因的真核表达载体p HAGE-L-OMP19和p HAGE-U-OMP19,二者转染细胞后表达的L-OMP19和U-OMP19蛋白可与特异性抗体反应;L-OMP19和U-OMP19不引起Huh7.5.1细胞凋亡,但可引起JEG-3细胞的大量坏死。结论成功构建可用于慢病毒包装的L-OMP19和U-OMP19真核表达载体,胞内重组表达的脂蛋白OMP19具有良好的抗原性,为研究布鲁杆菌脂蛋白在宿主细胞内作用机制提供实验材料。     

HCV 1b亚型ISDR变异影响PEG-IFN/RBV抗病毒疗效的新特点分析

目的探讨HCV干扰素敏感决定区（ISDR）氨基酸（aa）序列变异度对聚乙二醇干扰素（PEG-IFN）联合利巴韦林（RBV）治疗1b亚型慢性丙型肝炎（CHC）疗效的影响。方法 58例HCV1b亚型慢性感染者采用PEG-IFN/RBV联合方案治疗48周,并随访24周。定量检测血清HCV RNA,逆转录-聚合酶链反应扩增治疗前血标本中HCV ISDR片段并测序,MEGA4分析氨基酸序列变异度;二分类Logistic回归分析各变量与持续病毒学应答（SVR）之间的关系。结果治疗前血清HCV的ISDR氨基酸序列与HCVJ株比较,15例为野生型（未突变）,42例为中间型（1-3个突变）,1例为突变型（≥4个突变）。其中2218位点突变最多,约为60.3%（35/58）。ISDRaa突变数目与SVR关系密切（P=0.000）,ISDRaa突变数≥2的CHC组所获得的EVR和SVR明显高于aa突变数〈2的CHC组（P=0.041/P=0.012）。结论华南HCV1b亚型ISDR突变型（氨基酸变异≥4）极少。ISDRaa变异能够预测SVR;采用PEG-IFN/RBV联合方案治疗,对SVR有预测价值的ISDRaa突变数可由4个减少为2个。     

HCV1b亚型ISDR变异影响PEG-IFN/RBV抗病毒疗效的新特点分析

目的 探讨HCV干扰素敏感决定区(ISDR)氨基酸(aa)序列变异度对聚乙二醇干扰素(PEG-IFN)联合利巴韦林(RBV)治疗1b亚型慢性丙型肝炎(CHC)疗效的影响.方法 58例HCV 1b亚型慢性感染者采用PEG-IFN/RBV联合方案治疗48周,并随访24周.定量检测血清HCV RNA,逆转录-聚合酶链反应扩增治疗前血标本中HCV ISDR片段并测序,MEGA 4分析氨基酸序列变异度;二分类Logistic回归分析各变量与持续病毒学应答(SVR)之间的关系.结果 治疗前血清HCV的ISDR氨基酸序列与HCVJ株比较,15例为野生型(未突变),42例为中间型(1-3个突变),1例为突变型(≥4个突变).其中2218位点突变最多,约为60.3％(35/58).dSDR aa突变数目与SVR关系密切(P=0.000),ISDR aa突变数≥2的CHC组所获得的EVR和SVR明显高于aa突变数＜2的CHC组(P=0.041/P=0.012).结论 华南HCV 1b亚型ISDR突变型(氨基酸变异≥4)极少.ISDR aa变异能够预测SVR;采用PEG-IFN/RBV联合方案治疗,对SVR有预测价值的ISDR aa突变数可由4个减少为2个.     

输血医学专业高等教育模式的探索

目的 高质量输血医学学历教育是培养专业人才基本素质,进而提升输血医学行业服务质量与水平的根本保障.方法 以南方医科大学临床医学5年本科专业资源为依托,结合高质量的国内与国际输血医学教育资源,有计划、有目标、分阶段、分层次地开展先进理念的教学模式,特别吸收发达国家的先进知识与技术,补充专业教学内容,突出先进性,提高教学质量,改善输血医学专业学生知识结构.建立教学效果评价制度,以保证课程水平和教学质量的重要环节.结果 从全校公共基础课入手,注重临床专业课程(执业医师考试科目)与生物技术专业课程的结合,遴选26门课程进行学习;强化4门输血医学专业主干课程进行重点建设,使得核心课程模块可以满足输血医学相关领域中临床型和技术型两类人才培养的有机结合.挖掘国内优秀资源,聘请血液中心、医院输血科和研究机构的专家,结合各自优势整合在输血医学专业课中,开展专题内容讲授.同时,聘请美国耶鲁大学医学院输血医学领域著名专家,以远程教学模块形式,在《输血技术学》和《临床输血学》的课程之上,独立地开展新知识和新技术的教学工作.理论课程实施以知识点为模块,联系基础、拓展应用的构建模式,在选修课模块中,根据大学生文化素质教育的具体要求,从校50多门文化素质教育课程中遴选出10门课,以带动我校输血医学专业教学水平的整体提高.实验课程设计了自主设计性实验和综合设计性实验.实践教学以培养输血医师和输血技师为基本目标,安排学生在教学医院进行42周的临床实习和10周的血液中心(血站)技能实习.结论 明确南方医科大学输血医学专业为临床医学的一个方向,最大限度促进了专业教育国际化进程,初步制定了符合我国输血医学专业岗位需求的输血医学本科高等教育方案,使毕业生获得考取临床医师执照资格的专业知识与技能,具备输血医师的临床输血治疗或指导合理用血能力,以及输血技师的专业背景和特长,进而适应日益提高的输血医学岗位或继续教育要求.     

联合分析HCV种属信息区和高度保守区序列确定广东地区HCV基因型和亚型

目的扩增HCV种属信息区NS5B和高度保守区5-UTR基因序列,用系统进化树法深入分析HCV基因型和亚型,阐明广东地区丙型肝炎患者HCV基因型和基因亚型的特点。方法采集99例慢性丙型肝炎病例血清,应用RT-PCR技术分别扩增HCVNS5B区和5-UTR特定片段,测序后进行系统进化树分析,确定HCV基因型及亚型。结果99例患者标本均准确分型,其中NS5B区段分型74例,5-UTR区段分型99例。HCV基因型和亚型的分布:1a亚型1例、1b亚型59例、1型7例、2a亚型11例、3a亚型3例、3b亚型2例、3型3例、6a亚型13例;另有2例标本在两区段分型不同,5-UTR/NS5B区段分型分别为6a/1b和3a/1b。两区段共同分型74例,72例标本在两区段基因型一致,2例标本在两区段基因型不同,为HCV重组体。结论联合分析HCV不同区段基因序列,可提高HCV基因分型的准确度及灵敏性。广东地区慢性丙型肝炎患者HCV基因亚型分布以1b为主;其次为6a和2a;3型中的a、b亚型也占有一定比例。     

西尼罗病毒前膜蛋白在果蝇细胞S2中的表达与鉴定

目的克隆西尼罗病毒(WNV)前膜蛋白(prM)基因,将其在果蝇细胞(S2)中表达,为制备研制诊断试剂所需的单克隆抗体奠定基础。方法以质粒WNV-CME为模板,PCR扩增获得prM基因,与T载体连接,测序正确后酶切,酶切产物与果蝇表达载体pMT/Bip/V5-HisC重组,重组质粒与pCoBlas共转染果蝇S2细胞,25μg/ml Blasticidin筛选获得抗性细胞,500μmol/L CuSO4溶液诱导表达,72h后收集细胞与细胞上清进行Western blot鉴定。结果酶切与测序结果表明成功构建重组表达载体WNV-prM-pMT,Western blot显示目的蛋白在果蝇细胞S2内稳定表达。结论在果蝇S2细胞内成功地稳定表达WNV prM蛋白,为下一步WNV单克隆抗体的制备奠定了实验基础。     

羊布鲁杆菌脂蛋白OMP19单克隆抗体制备与鉴定

目的 制备与鉴定羊布鲁杆菌脂蛋白OMP19单克隆抗体,用于布菌感染免疫机制研究。方法 将OMP19基因连接入pET-30a(+)表达载体中,构建pET-30a(+)/OMP19质粒,转化入大肠埃希氏菌BL21(E3),以不同浓度异丙基-β-D硫代半乳糖苷(IPTG)进行诱导表达,采用镍金属螯合亲和层析(NI-NTA)纯化;以布菌阳性血清检测重组蛋白免疫反应性,并利用杂交瘤技术制备单克隆抗体,以天然OMP19蛋白及布菌外膜蛋白提取物(NMP)对制备的单克隆抗体进行Western Blot及酶免疫染色试验(IEST)鉴定。结果 表达了OMP19蛋白,分子量约19 kDa,通过纯化纯度可达95%,Western Blot分析显示蛋白具有良好的抗原性,并制备了OMP19抗原23株鼠源性单克隆抗体,鉴定结果 显示22(95.65%)株能与天然OMP19蛋白反应,18(78.26%)株能与NMP反应,其中IgG1(k)亚型占91.30%;4株能与羊种布鲁氏菌菌涂片反应。结论 成功制备具有良好抗原性的重组OMP19蛋白,筛选出识别天然蛋白的单克隆抗体,已初步应用于布菌的检测,为OMP19抗原B细胞表位的筛选奠定基础。     

GPC-3CTL表位表达载体构建

将重组的乙肝表面抗原(pcHBsAg)中多个CTL表位,用外源性的磷酸酰肌醇蛋白聚糖-3蛋白(GPC3)CTL表位序列替换,构建单拷贝和多拷贝DNA疫苗,获得不同位点的单拷贝或可同时表达多个CTL表位肽的真核表达质粒.以pcHBsAg质粒为模板,应用重叠延伸PCR扩增出含三个不同位点磷酸酰肌醇蛋白聚糖-3蛋白(GPC3)CTL表位EYILSLEEL(EYI)的HBsAg基因片段EYI1,及替换pcHBsAg中不同CTL表位的HBsAg基因片段EYI2、EYI3;分别将EYI1、EYI2、EYI3基因片段插入pBSSK+载体中,构建出含3拷贝EYI的pBSSK/EYI1、pBSSK/EYI2、pBSSK/EYI3载体.在此基础上,利用DNA重组技术将其分别定向插入真核表达载体pcDNA3.1+,构建表达EYI表位肽的DNA疫苗.真核表达载体经PCR、酶切和测序鉴定,结果显示:成功构建了pcDNA.EYI1/HBsAg、pcDNA-EYI2/HBsAg、pcDNA-EYI3/HBsAg真核表达质粒,为进一步测定以GPC3基因为基础的HBsAg多肽候选疫苗提供理论、实验依据.

Abstract：

Objective To construct the expression vectors of GPC-3 CTL epitope. Methods The HBsAg gene with three different EYILSLEEL (EYI) sites was named EYI1, and another with one EYI replacing CTL epitope FLG or SIL of pcHBsAg were named EYI2 and EYI3, respectively. All the three DNAs were amplified by SEOing PCR from pcHBsAg plasmid and linked into pBSSK+ vector to construct pBSSK/EYI1, pBSSK/EYI2, and pBSSK/EYI3. The three plasmid were identified by PCR, double digestion and sequencing, and the fragments with EYI1-3 were obtained by double digestion and then inserted into pcDNA3.1+ vector. Results and Conclusion PCR, enzyme digestion and sequence analysis confirmed successful construction of the eukaryotic expression vectors pcDNA-EYI1/HBsAg, pcDNA-EYI2/HBsAg, pcDNA-EYD/HBsAg, which facilitate further studies of the GPC3-HBsAg multiple peptides vaccine for HBV infection.