猪和小鼠endoglin原核表达载体的构建及重组蛋白的诱导表达和纯化

目的:体外扩增猪和小鼠endoglin胞外段基因序列,构建猪和小鼠endoglin重组原核表达质粒,在大肠杆菌中诱导表达,并对表达产物进行分离、纯化和鉴定.方法:设计猪和小鼠endoglin胞外段基因序列的引物,利用RT-PCR技术扩增克隆猪和小鼠endoglin胞外段基因序列,通过限制性核酸内切酶酶切,然后用T7酶连接,构建猪和小鼠endoglin胞外段的原核表达质粒pQE-pEDG和pQE-mEDG.筛选的重组质粒经酶切和DNA序列测定等证实正确后,再转染感受态大肠杆菌JM109,用IPTG诱导表达.表达产物经Ni-NTA亲合层析进行分离纯化,最后用SDS-PAGE和免疫印迹法进行鉴定.结果:琼脂糖凝胶电泳发现扩增克隆的猪和小鼠endoglin胞外段基因序列分子量大小和预期值相一致,酶切分析显示,pQE-pEDG和pQE-mEDG和预期值相符,DNA序列测定显示,目的基因片段和阅读框架正确无误.重组蛋白质在大肠杆菌中获得稳定表达,表达的重组蛋白分子量与预期值相一致,纯化的蛋白浓度达90%以上,抗小鼠endoglin抗体可特异性识别pEDG和mEDG.结论:成功构建了猪和小鼠endoglin的原核表达载体,并在大肠杆菌中诱导表达并纯化,为进一步了解重组endoglin蛋白质作为疫苗是否可以有效诱导产生抗自身endoglin的免疫反应奠定了基础.     

小鼠IL-5真核表达质粒的构建和体外表达

目的 构建小鼠白细胞介素-5（IL-5）基因真核表达质粒,了解该质粒在真核细胞COS细胞中有效表达情况.方法 以含有小鼠IL-5基因的克隆质粒pORF9-mIL-5为模板,通过PCR扩增小鼠IL-5全段基因,应用基因工程技术将扩增的基因片段插入peDNA3.1（＋）真核表达质粒,构建重组真核表达质粒pcDNA-m IL-5,经限制性内切酶酶切分析及测序鉴定正确后,用脂质体转染技术转染COS细胞,用Western Blot鉴定该质粒是否能够在真核细胞中表达相应的目的蛋白质.结果 成功扩增了小鼠IL-5全长基因,酶切和测序证明正确构建了重组真核表达质粒pcDNA-m IL-5,Westem blot方法证实该质粒能在COS真核细胞中有效表达小鼠IL-5目的蛋白.结论 成功构建了小鼠IL-5基因的真核表达质粒载体,为进一步研究IL-5的新功能和免疫基因治疗奠定了基础.     

门诊儿童哮喘病人的循证教育

循证护理(Evidence-Based Nursing，EBN)是指护士慎重、准确和明智地应用所能获得的最好研究证据，同时结合护士个人的专业技能和多年的临床经验，并且考虑病人的价值和愿望，将三者完美结合，制定出最适合病人实际需要的护理措施。EBN将促使护理学从传统的经验护理模式     

猪endoglin胞外段重组蛋白疫苗抗肿瘤作用机制研究

目的:研究猪endoglin胞外段重组蛋白(pEDG)作为异种蛋白疫苗是否能够诱导小鼠产生抗自身endoglin的免疫反应,从而抑制endoglin相关的肿瘤血管生成,进而抑制肿瘤的生长.方法:观察免疫治疗的荷瘤小鼠肿瘤体积和生存情况,用免疫组化方法(抗CD31)观察肿瘤组织血管生长并计算肿瘤微血管密度,用免疫荧光方法了解肿瘤血管自身抗体沉积,用Western blot和ELISA方法检测荷瘤小鼠免疫治疗后的血清是否含有抗自身endoglin的抗体和抗体亚型,用ELISPOT方法检测荷瘤小鼠脾脏中分泌抗endoglin抗体的B淋巴细胞.结果:与同种重组endoglin蛋白和非疫苗对照组二个对照组相比,重组pEDG蛋白疫苗主动免疫治疗可以明显抑制小鼠肿瘤的生长,小鼠生存时间明显延长,肿瘤组织中血管生成明显减少,肿瘤组织血管表面有自身抗体沉积,血清中含有抗自身endoglin的抗体,抗体亚型主要为IgG1和IgG2b.此外,免疫治疗组小鼠脾脏中还发现明显增多的分泌抗自身endoglin抗体的B淋巴细胞.结论:pEDG疫苗诱导抗自身endoglin抗体的产生,从而抑制肿瘤血管生成和肿瘤生长.这种主动免疫治疗的方法有望成为治疗肿瘤的新策略.     

猪endoglin重组蛋白疫苗和低剂量顺铂联合治疗肿瘤研究

目的:观察重组猪endoglin胞外段蛋白疫苗和化疗药物顺铂联合治疗是否具有更好的抗肿瘤作用.方法:在LL/2肺癌和CT26结肠腺癌二个肿瘤模型中观察重组猪endoglin蛋白疫苗和小剂量顺铂联合治疗(Cis-pEDG)、顺铂(Cis)和疫苗(pEDG)单独治疗及非治疗(生理盐水,NS)组荷瘤小鼠不同时间段的肿瘤体积和生存时间,抽血检测肝、肾功能,用免疫组化方法(抗CD31)观察肿瘤组织血管生长并计算肿瘤微血管密度,Western blot方法检测各组荷瘤小鼠血清中是否含有抗自身endoglin的抗体,ELISPOT方法检测荷瘤小鼠脾脏中分泌抗自身endoglin抗体的B淋巴细胞,TUNEL检测肿瘤细胞凋亡.结果:和Cis、pEDG和NS相比,Cis-pEDG联合治疗组荷瘤小鼠的肿瘤体积明显减少,生存时间明显延长,肿瘤微血管密度明显减少,肿瘤细胞凋亡明显增加,3个指标计算的协同指数均大于1.Cis-pEDG和pEDG治疗组小鼠血清中均含有抗小鼠endoglin的抗体,两组荷瘤小鼠的脾脏中含有的分泌抗小鼠endoglin的B淋巴细胞数量明显高于Cis和NS组,而Cis和NS组之间的B淋巴细胞数量无显著性差异;各组荷瘤小鼠外周血白细胞及肝、肾功能没有明显异常.结论:猪endoglin蛋白疫苗和小剂量顺铂联合治疗没有明显的不良反应,但具有协同抗肿瘤作用,小剂量顺铂治疗不导致免疫抑制,二者联合是一种行之有效的肿瘤治疗新策略.     

Anti-angiogeneic Target Therapy for Cancer with Vaccine Based on the Recombinant Chicken FGFR-1 in Tumor-bearing Mice

To explore the anti-tumor effect of immunotherapy with recombinant protein vaccine based on FGFR-1 of chicken (cFR-1) in a mouse Meth A fibrosarcoma model, tumor volume and sur- vival rate of the mice were observed at a 3-day interval. Microvessel density (MVD) was detected by immunohistochemistry. Auto-antibodies against self-FGFR-1 were detected by Western blotting and ELISA, respectively. The anti-FGFR-1 antibody-producing B cells (APBCs) were detected by enzyme-linked immunospot (ELISPOT) assay. Eighteen days after inoculation of tumor cells, the tumor volume was significantly smaller in cFR-1-immunized group than in mouse FGFR-1 (mFR-1) immunized group and normal saline (NS) control group (P<0.05), and the survival time was signifi- cantly longer in cFR-1-immunized group than in the control groups (P<0.01). MVD was significantly lower in cFR-1-immunized group than in mFR-1-immunized group and NS group (16.8 ±5.6 vs 64.6±1.8 and 59.6±8.7, P<0.01). Antibodies against self-FGFR-1 were found in mFR-1-immunized group, the major antibody subclasses were IgG1 and IgG2b. Compared with the two control groups, the numbers of APBCs in cFR-1-immunized group were significantly increased (P<0.01) These re- sults demonstrated that the cFR-1-related anti-angiogenesis protein vaccine could induce the produc- tion of auto-antibodies against self-FGFR-1, which futher inhibit angiogenesis and growth of solid tumor.     

抗小鼠endolgin单克隆抗体杂交瘤的建立和初步应用

目的 建立能够分泌特异性抗小鼠endogun的单克隆抗体杂交瘤细胞系，为深入研究endoglin的新功能、诊断和治疗肿瘤血管生成提供物质基础。方法 利用小鼠endc，glin胞外段重组蛋白作为抗原免疫大鼠，通过细胞融合和杂交瘤筛选技术建立特异分泌抗小鼠endoglin单克隆抗体的杂交瘤系。利用酶联免疫吸附方法确定单克隆抗体亚型，免疫印迹方法明确筛选的单克隆抗体的特异性，免疫组化和免疫荧光初步判定获得的单克隆抗体是否可以应用于临床诊断。结果通过对90多个分泌抗体的融合细胞克隆的筛选，获得一株分泌特异性抗小鼠endoglin的单克隆抗体杂交瘤细胞系，分泌的单克隆抗体亚型为IgG1，轻链亚型为kappa。免疫印迹显示该研究获得的单克隆抗体可以特异识别小鼠endoglin重组蛋白，该单克隆抗体可以结合实体肿瘤组织微血管上的特异抗原并将微血管有效染色。结论本研究所获得的抗小鼠endglin单克隆抗体将有助于深入研究endoglin的新功能，为肿瘤血管生成的诊断和治疗提供了物质保障。     

Ag43/FGFR1嵌合蛋白疫苗诱导小鼠产生特异性抗体的研究

目的 了解Antigen43/成纤维细胞生长因子1型受体(Ag43/FGFR1)重组嵌合蛋白作为疫苗能否诱导小鼠产生抗自身FGFR1抗体.方法 利用重组的Ag43/FGFR1嵌合蛋白作为疫苗免疫BALB/c小鼠,分别用Westernblot、酶联免疫吸附实验(ELISA)和酶联免疫斑点实验(ELISPOT)方法检测小鼠血清中产生的抗体及其亚型和脾脏中分泌抗FGFR1抗体的特异B淋巴细胞情况.结果 Western blot和ELISA检测发现,Ag43/FGFR1蛋白免疫组可以有效诱导产生抗自身FGFR1抗体,而小鼠FGFR1自身蛋白对照组、Ag43蛋白对照组、生理盐水对照组均未发现抗自身FGFR1抗体.ELISPOT检测发现,与各对照组相比,Ag43/FGFR1蛋白免疫组分泌抗自身FGFR1抗体的B淋巴细胞数目明显增多(均P<0.01).ELISA检测发现主要抗体亚型IgG1和IgG2b明显升高.结论 Ag43/FGFR1重组嵌合蛋白质疫苗免疫小鼠能够诱导产生抗小鼠FGFR1的自身抗体,可以考虑应用于抗肿瘤血管生成研究.