LAK细胞之诱导条件的探讨

目的　探讨 L AK细胞的诱导条件。方法　采用不同含量的 r- IL- 2 T和 PHA制备 L AK细胞 ,经台盼兰拒染实验计数法及 MTT比色法检验 L AK细胞数目及活性。结果　在 r- IL- 2 30 0 μ/ ml和 PHA10 μg/ ml时 ,制备的 L AK细胞数量多 ,杀伤活性较高。结论　结论 r- IL- 2和 PHA可诱导 L AK细胞增殖。     

腹腔注射人淋巴细胞建立人肝癌PBL-SCID嵌合模型

目的　探索建立人肝癌PBL SCID嵌合模型的方法。方法　C57/BL SCID小鼠腹腔注射健康志愿者外周血淋巴细胞(huPBL) 2×107 (1 0 ml),同时右腋部皮下注射 5×105 (0 2 ml)HepG2细胞。第2、4周鼠尾取血ELISA法测定人 IgG含量,用流式细胞仪分析小鼠外周血单个核细胞中人淋巴细胞比例。4周MTT法测定小鼠脾细胞对 HepG2 细胞的杀伤能力,免疫组化检测小鼠脾脏中人淋巴细胞的存在。结果　模型成瘤率为100%,成瘤潜伏期12~18 d。2、4周时小鼠血中人IgG 分别达69 8μg/ml、125 9μg/ml,人淋巴细胞占单核细胞的比例分别为 10 5%和 3 5%。4周时免疫组化检测出人淋巴细胞分布于小鼠脾脏中,小鼠脾细胞对 HepG2 细胞的杀伤力为 20 3%。处死动物,常规病理切片见肿瘤生长。结论　SCID小鼠腹腔注射人淋巴细胞、皮下注射肝癌细胞可建立人肝癌PBL SCID嵌合模型。     

人神经营养素-3受体基因的扩增及其重组腺病毒载体的构建

【目的】构建人神经营养素-3（neurotrophin-3，NT-3）受体（即酪氨酸蛋白激酶受体C，tyrosine protein kinase C，TrkC）基因重组的腺病毒表达载体。【方法】从人脑组织mRNA中扩增Trkc基因全长cDNA，定向克隆于穿梭质粒pShuttle中，获得一个带有CMV启动子的表达盒。再将表达盒与腺病毒骨架DNA（Adeno-X viral DNA）体外连接，形成重组腺病毒质粒（pAd-TrkC）。用pAd-TrkC转染人胚肾293细胞后包装成有感染能力的重组腺病毒颗粒（Adeno-Trkc）。【结果】TrkC基因RT-PCR扩增产物为2478bp。Adeno-TrkC经PCR鉴定为正确重组子。【结论】应用体外连接法已构建了人TrkC重组腺病毒表达载体，这为进一步应用NT-3进行基因治疗中枢神经损伤奠定了基础。     

人神经营养素-3受体基因的扩增及其重组腺病毒载体的构建

[目的]构建人神经营养素-3(neurotrophin-3,NT-3)受体(即酪氨酸蛋白激酶受体C,tyrosine protein kinase C,TrkC)基因重组的腺病毒表达载体.[方法]从人脑组织mRNA中扩增TrkC基因全长cDNA,定向克隆于穿梭质粒pShuttle中,获得一个带有CMV启动子的表达盒.再将表达盒与腺病毒骨架DNA(Adeno-X viral DNA)体外连接,形成重组腺病毒质粒(pAd-TrkC).用pAd-TrkC转染人胚肾293细胞后包装成有感染能力的重组腺病毒颗粒(Adeno-TrkC).[结果]TrkC基因RT-PCR扩增产物为2 478 bp.Adeno-TrkC经PCR鉴定为正确重组子.[结论]应用体外连接法已构建了人TrkC重组腺病毒表达载体,这为进一步应用NT-3进行基因治疗中枢神经损伤奠定了基础.     

严重急性呼吸道综合征冠状病毒Spike蛋白抗原特异性的临床应用研究

目的 探讨严重急性呼吸道综合征（SARS）患者的SARS冠状病毒（SARS—CoV）抗体产生情况以及SARS-CoVSpike蛋白抗原的特异性。方法 运用酶联免疫法（ELISA）和蛋白质印迹法（WesternBlotting）检测95例SARS患者体内抗体的产生情况和验证病毒Spike蛋白抗原的特异性。结果 95例SARS患者血清抗体结果中，大部分患者出现抗体阳性，抗SARS-CoVIgM总阳性率为91．6％（87／95），抗SARS-CoVIgG总阳性率为97．9％（93／95）；高暴露人群组和正常对照组的抗SARS-CoVIgM和抗SARS-CoVIgG阳性率为0％。经过携带Spike-protein基因的重组病毒Ad-sn感染COS-1细胞后表达的s蛋白抗原，使用SARS患者抗血清能够检测出特异性蛋白条带；重组病毒感染CNE-2细胞后，表达的S蛋白抗原，能够通过不同患者抗血清同时检测到相应的特异性抗原蛋白。结论 SARS患者感染SARS-CoV后，体内可产生相应抗体；利用SARS患者所产生特异性抗血清，可以检测出克隆SARS-CoV的Spike基因所表达的Spike蛋白。     

携带SARS-CoV刺突蛋白N端片段重组腺病毒的构建

[目的]构建携带SARS冠状病毒刺突蛋白N端基因片段的重组腺病毒.[方法]从SARS病毒cDNA扩增刺突蛋白N端基因片段(-45～1469nt,截短的S1区,SN),插入腺病毒穿梭质粒pShuttle,通过体外连接法构建重组腺病毒Ad-SN.用Ad-SN感染Vero-E6细胞,通过RT-PCR和Western blot法检测SN的表达.[结果]克隆的SN基因序列与文献报道基本一致;Ad-SN基因组结构与预期一致.在Ad-SN感染的Vero-E6细胞中存在SN基因的转录和分泌型SN蛋白的表达.[结论]体外连接法是一种简便易行的重组腺病毒载体构建方法;重组腺病毒Ad-SN能正确表达分泌型SN蛋白,可用于诱导抗SARS免疫的动物实验研究.     

三七总皂苷抑制肝细胞钙超载的机制

目的通过测定大鼠肝细胞内游离钙离子浓度（［Ｃａ２＋］ｉ）,观察三七总皂苷（ＰＮＧＳ）对肝细胞Ｃａ２＋浓度的影响,探讨其抑制肝细胞钙超载的机制。方法胶原酶分离大鼠肝细胞,Ｆｕｒａ ２／ＡＭ技术测定［Ｃａ２＋］ｉ,研究ＰＮＧＳ对静息和被激动状态下肝细胞［Ｃａ２＋］ｉ的影响。结果１０ｎｍｏｌ·Ｌ－１血管加压素及１０ｎｍｏｌ·Ｌ－１血管紧张素分别使肝细胞［Ｃａ２＋］ｉ增加２００％和９４％,ｖｅｒａｐａｍｉｌ、ｎｉｆｅｄｉｐｉｎｅ和ＰＮＧＳ均能不同程度地抑制血管加压素、血管紧张素激动引起的肝细胞［Ｃａ２＋］ｉ升高,ＰＮＧＳ的抑制作用显著强于ｖｅｒａｐａｍｉｌ、ｎｉｆｅｄｉｐｉｎｅ且呈明显的剂量依赖性。ＰＮＧＳ还能轻度降低静息状态下肝细胞［Ｃａ２＋］ｉ,而ｖｅｒａｐａｍｉｌ、ｎｉｆｅｄｉｐｉｎｅ无此作用。结论ＰＮＧＳ能特异性阻断肝细胞膜上受体依赖性钙通道（ＲＯＣ）,抑制肝细胞的钙内流,阻断肝细胞内源性ＩＰ３途径,防止肝细胞内钙超载。ＰＮＧＳ抑制钙超载机制还可能与其本身轻度结合钙离子有关。     

SCID鼠人肝癌皮下移植及免疫重建复合模型的建立

目的　探索建立稳定的SCID鼠人肝癌皮下移植及免疫重建 (人HCC PBL SCID)复合模型的方法。方法　经SCID鼠腹腔内注射人PBL、皮下接种人肝癌细胞 ,定期检测SCID鼠体内人淋巴细胞及其功能、观察皮下成瘤潜伏期及成瘤率。结果　人HCC PBL SCID复合模型鼠和单纯人HCC SCID模型鼠成瘤率均为 10 0 % ,但前者成瘤潜伏期显著延长、肿瘤明显缩小 (P分别 <0 0 1、<0 0 5 )。人HCC PBL SCID复合模型鼠第 2、4、6周时小鼠血中人IgG分别为 (6 9 8± 11 6 ) μg/ml、(12 5 9± 13 7) μg/ml和(183 1± 9 0 ) μg/ml,人CD3 淋巴细胞占单核细胞分别为 (10 5± 5 2 ) %、(9 7± 2 9) %和 (8 4± 2 4 ) %。复合模型鼠第 4、6周的小鼠脾细胞对HepG2细胞的杀伤力分别为 (2 0 3± 8 7) %和 (2 2 0± 2 3) %。免疫组化检测显示小鼠脾脏、胸腺、肿瘤组织中均有较多的人CD3 淋巴细胞分布。结论　采用腹腔注射人PBL、皮下接种人肝癌细胞的方法可以有效地建立人HCC PBL SCID嵌合模型。此模型较好地模拟了肝癌的人体内情况 ,是肝癌免疫基因治疗的较理想模型。     

重组人血管内皮抑素腺病毒对人癌裸小鼠移植瘤的抑制作用

目的　观察重组人血管内皮抑素腺病毒 (Ad/hEndo)在体内、体外的表达效率 ,以及对裸鼠移植瘤肿瘤血管生成的影响。方法　携带人血管内皮抑素基因的新型重组腺病毒 (Ad/hEndo)及携带β 半乳糖苷酶基因 (LacZ基因 )的重组腺病毒 (Ad/LacZ)为自行构建。Ad/hEndo组 (7只 )瘤内注射 1× 10 9空斑形成单位 (pfu)的Ad/hEndo 10 0 μl,Ad/LacZ注射组 (6只 )瘤内注射 1× 10 9pfu的Ad/LacZ注射 10 0 μl,DMEM液注射组 (5只 )瘤内注射DMEM液 10 0 μl,共注射 5次。人鼻咽癌 (CNE 2 )和人脐静脉内皮细胞 (ECV30 4细胞 )被Ad/hEndo感染后 ,Western印迹和免疫酶联吸附法 (ELISA)检测人血管内皮抑素蛋白的表达。CNE 2细胞株移植到裸鼠背脊部后 ,检测Ad/hEndo对鼻咽癌裸鼠移植瘤生长的抑制作用 ,微血管密度计数 (microvesseldensity ,MVD)分析Ad/hEndo对肿瘤血管生成的影响。结果　Western印迹和ELISA法检测到人血管内皮抑素基因在CNE 2和ECV30 4细胞高效表达。当感染复数 (MOI)为 2 0pfu/细胞时 ,感染 72h后细胞培养上清中人血管内皮抑素蛋白浓度达 5 88 34ng/ml。Ad/hEndo可明显抑制鼻咽癌CNE 2裸鼠移植瘤生长 ,抑瘤率为 4 6 4 3% (Ad/hEndo治疗组对腺病毒携带基因LacZ注射组 ,t=2 2 2 6 ,P <0 0 5 )和 4 9 70 % (     

小鼠 T-bet基因重组腺病毒载体的构建

[目的] 构建小鼠 T-bet基因重组腺病毒载体,为 T-bet基因在支气管哮喘治疗中的作用研究提供有效的 T-bet生物表达系统.[方法] 采用内切酶从质粒 T-bet/GFP-RV中切获约 1.7 kb的小鼠 T-betcDNA片段,与穿梭质粒 pShuttle连接,再通过稀有酶切位点将含 T-betcDNA的表达盒与 Adeno-X腺病毒载体骨架连接,构建重组载体 pAdeno-T-bet,测序鉴定无错配及插入移位等 DNA顺序改变,并转染 HEK293细胞,出现 CPE后取含病毒上清的细胞培养液抽提病毒 DNA行 PCR鉴定.[结果] PCR及酶切证实: T-betcDNA正确克隆到穿梭质粒 pShuttle中,带 T-betcDNA的表达盒成功重组到腺病毒载体基因组 E1A缺失区,并在 HEK293细胞中成功包装出具有感染活性的重组腺病毒 pAdeno-T-bet.[结论]本实验成功构建了小鼠 T-bet基因重组腺病毒载体,并在 HEK293细胞中成功包装出重组腺病毒.