HSV-TK/HSV-sr39TK基因工程T细胞的研制

目的：制备慢病毒载体为基础的野生型及突变型单纯疱疹病毒胸苷激酶（HSV-TK/HSV-sr39TK）基因工程T细胞（TK^＋T及sr39TK^＋T细胞）,观察给予前体药物丙氧鸟苷/无环鸟苷后小鼠T淋巴细胞对其敏感性及存活情况。方法：构建含HSV-TK/HSV-sr39TK及内部核糖体进入位点序列（IRES）和绿色荧光蛋白基因（GFP）的双顺反子慢病毒载体;采用磷酸钙沉淀法将慢病毒载体三质粒转染293T细胞,收集病毒上清感染刀豆蛋白刺激的小鼠T淋巴细胞,给予不同浓度的前体药物GCV/ACV,用Cell Counting Kit（CCK-8）等方法检测T细胞的存活率。结果：转染293T细胞后,病毒滴度达10^6/U/ml以上;含不同启动子的病毒载体转染效率CMV〉PUB〉PGK,对小鼠T淋巴细胞的感染效率以CMV启动子最高;IC50值的测定显示sr39TK^＋T细胞对GCV和ACV的敏感性较TK^＋T细胞分别提高约2.5和17.4倍;ACV及GCV浓度在1～10μmol/Lsr39TK^＋T细胞活率下降最为明显,ACV组细胞存活率由（98.4±2.7）%下降为（49.9±5.9）%,GCV组由（97.9%±2.7）%下降为（33.7±5.3）%,P〈0.05,随ACV及GCV浓度的增加,细胞活率下降趋势有所减弱;TK^＋T细胞对GCV敏感,细胞活率由（97.9±2.7）%下降为（38.4±5.5）%,（P〈0.05）,对ACV不敏感,细胞活率由（98.4±2.7）%下降为（73.8±7.4）%,P〉0.05。结论：成功构建了HSV-TK/HSV-sr39TK基因工程T细胞,不同启动子对慢病毒载体在293T细胞的转染效率、转导自杀基因在T淋巴细胞内的表达均有影响;HSV-sr39TK^＋T细胞对GCV和ACV的敏感性高于TK^＋T细胞。     

慢病毒介导的血友病B基因在离体细胞中的表达

目的 构建泛醌启动子(PUB)驱动的携带犬凝血因子Ⅸ(cFⅨ)基因的慢病毒三质粒表达载体,将其包装成病毒后,观察是否能在体外获得有效的cFⅨ表达.方法 采用改良的磷酸钙沉淀法将包装质粒ANRF、包膜蛋白质粒VSV-G和构建的重组转移质粒PTK 164共转染293T包装细胞产生慢病毒颗粒,病毒以MOI 3:1比例感染培养的第三代骨髓基质细胞和293T细胞,用一期法测定细胞培养上清中cFⅨ活性.结果 体外成功培养出骨髓基质细胞,经病毒感染后的骨髓基质细胞和293T细胞均能表达FIX因子,活性分别为(26.30±2.10)%和(19.70±1.53)%,与对照组[(1.00±0.05)%]比较,差异有统计学意义.结论 成功构建PUB启动子驱动的cFⅨ基因的三质粒慢病毒表达载体,包装成病毒颗粒后成功转染至培养的骨髓基质细胞和293T细胞. 移质粒PTK 164共转染293T包装细胞产生慢病毒颗粒,病毒以MOI 3:1比例感染培养的第三代骨髓基质细胞和293T细胞,用一期法测定细胞培养上清中cFⅨ活性.结果 体外成功培养出骨髓基质细胞,经病毒感染后的骨髓基质细胞和293T细胞均能表达FIX因子,活性分别为(26.30± .10)%和(19.70±1.53)%,与对照组[(1.00±0.05)%]比较,差异有统计学意义.结论 成功构建PUB启动子驱动的cFⅨ基因的三质粒慢病毒表达载体,包装成病毒颗粒后成功转染至培养的骨髓基质细胞和293T细胞.     

多发性骨髓瘤60例临床分析

多发性骨髓瘤 (ｍｕｌｔｉｐｌｅｍｙｅｌｏｍａ ,ＭＭ)是克隆性浆细胞异常增生性疾病 ,多见于 6 0岁以上的老年人 ,约占恶性血液病的 10 %。该病早期临床表现复杂多样 ,易误诊或漏诊 ,常规化疗完全缓解率甚低 ,预后不良。现将我院 1992～ 2 0 0 1年收治住院、病历资料较为完整的 6 0例ＭＭ患者进行总结。1　临床资料1.1　一般资料　 6 0例患者中 ,男 39例 ,女 2 1例 ,男∶女 =1.86∶1。年龄 4 0～ 80岁 ,平均发病年龄为 (6 0 .2± 18.7)岁 ,其中 30～ 4 0岁者 1例 (1.7% ) ,4 1～ 5 0岁者 7例 (11.7% ) ,5 1～ 6 0岁者 2 0例 (33.3% ) ,6 1…     

筑巢式PCR检测22例慢性粒细胞白血病患者bcr/abl融合基因结果分析

目的：探讨bcl/abl融合基因在慢性粒细胞白血病（CGL）的诊断、治疗和预后判断的价值。方法：对22例CGL患者作筑巢式逆转录聚合酶链反应（RT－PCR）检测bcr/abl融合基因。结果：22例CGL患者中21例bcr/abl融合基因阳性，阳性率为95．5％。结论：筑巢式KPCR是一种快速、敏感而准确的检测方法。     

再生障碍性贫血患者血栓烷B_2和6－酮－前列腺素F_1α水平与出血的关系

再生障碍性贫血患者血栓烷Ｂ_２和６－酮－前列腺素Ｆ_１α水平与出血的关系徐开林，潘秀英，鹿照荣，鹿群先，万美蓉，刘翠英再生障碍性贫血（再障）出血的原因除血小板减少外，尚与血小板功能异常（血小板粘附率、聚集率及血小板第３因子有效性减低）等有关￣［１］。为...     

缓解期急性白血病患者定期骨髓检查的临床意义

急性白血病（AL）患者临床取得首次完全缓解（CR）后，一般应定期复查骨髓（BM），为证实其必要性，本文收集资料完整的82例CR后复发的AI，患者进行回顾性分析。临床资料82例AL患者系本院1987年5月～1997年5月确诊的住院和门诊病人，男38例，女44例，年龄9～6O岁，其中急性非淋巴细胞白血病47例，急性淋巴细胞白血病35例。所有病例均经临床和实验室证实，按全国血液病学学术会议拟定的标准诊断和分型。所有病例每周复查外周血（PB）1次，每月检查1次BM，由专职检验人员负责。BM复发定为原始细胞＞5％，PB出现原始细胞为异常，除外…     

米非司酮对人早孕绒毛、蜕膜组织血管生成的影响探讨

目的:探讨米非司酮对早孕绒毛与蜕膜组织血管生成的影响。方法:取服米非司酮及米非司酮配伍米索前列醇后的早孕绒毛与蜕膜组织,以负压吸引流产术的绒毛与蜕膜组织为对照组,应用免疫组织化学技术,观察米非司酮对血管内皮生长因子(VEGF)与微血管密度(MVD)的影响。结果:服用米非司酮、米非司酮配伍米索前列醇后,绒毛、蜕膜组织的VEGF分别由对照组的1.61±0.65分、1.61±0.77分,下降至0.83±0.58分、0.83±0.39分和0.80±0.63分、0.70±0.67分(P<0.05);其MVD值分别由10.70±2.24个、28.08±8.81个,下降至5.25±1.95个、18.58±4.83个和4.30±1.06个、17.80±4.29个(P<0.001、P<0.01)。服用米非司酮与米非司酮配伍米索前列醇,绒毛、蜕膜组织VEGF与MVD值无显著性差异。结论:米非司酮使早孕绒毛与蜕膜组织的VEGF与MVD值下降,这可能是米非司酮终止早孕的机理之一。     

昆明山海棠联合环孢素A防治小鼠急性移植物抗宿主病

移植物抗宿主病(graft-versus-host disease,GVHD)是影响异基因造血干细胞移植患者长期生存和生活质量的重要因素之一.临床常用的治疗包括糖皮质激素、环孢素A等免疫抑制剂,副作用大、费用高.昆明山海棠(tripterygium hypoglaucum hutch,THH)是一种中药免疫抑制剂,具有肾上腺皮质激素类疗效但无激素类副作用,停药后无反跳和戒断症状,且价格低廉.本研究拟将其应用于小鼠清髓性异基因骨髓移植模型中,以观察其是否有预防aGVHD的作用,通过测定受鼠血浆INF-γ、IL-4、IL-10浓度来探讨其可能的作用机制,并观察其是否能够减少CsA的用量.     

恶性淋巴瘤患者采用MAG方案进行干细胞动员的疗效观察

目的　观察恶性淋巴瘤患者进行自体外周血造血干细胞移植(APBSCT)前采用MAG方案动员干细胞的疗效.方法对进行APBSCT的12例恶性淋巴瘤患者,移植前动员均采用MAG方案,具体为阿糖胞苷(Ara-C)2g/m2每12h　1次,第1、2天；米托蒽醌(MTZ)　10　mg/m2,第2、3天.白细胞(WBC)计数＜1.0×109/L时开始使用重组人粒细胞集落刺激因子(rhG-CSF)　150μg/d,WBC　计数＜0.5×109/L时采用rhG-CSF　300μg/d,WBC计数开始回升时,每日检测血常规和观察外周血涂片,当外周血涂片中出现原始或幼稚细胞时给予rhG-CSF　300μg,每12h　1次,使用CS-3000血细胞分离机连续2d采集外周血干细胞并冻存备用.结果12例患者经MAG方案动员后,并发症主要为轻度感染.经两次采集,共采集到单个核细胞(MNC)(5.24±0.81)×108/kg,CD34+细胞(8.16±2.25)×　106/kg,均达到采集要求.结论恶性淋巴瘤患者采用MAG方案进行干细胞动员、采集,结果稳定可靠,安全性好.     

突变型自杀基因HSV1-sr39tk真核表达载体的构建与鉴定

 目的 克隆突变型单纯疱疹病毒胸苷激酶基因HSV1-sr39tk并构建其真核表达载体。方法 通过PCR扩增HSV1-sr39tk基因,用BamHⅠ和BglⅡ双酶切纯化的PCR产物,在T4DNA连接酶作用下于室温将其连接于经BamHⅠ单酶切的慢病毒载体转移质粒pTK151上,重组质粒经PstⅠ酶切及测序鉴定。结果 阳性重组质粒酶切及测序鉴定与预期结果完全相符。结论 成功克隆出突变型自杀基因HSV1-sr39tk,并成功构建其真核表达载体。