荧光定量PCR同步检测人类疱疹病毒6,7,8型方法的建立

目的:建立同步检测人类疱疹病毒6,7,8型(HHV-6,-7,-8)的多重荧光定量PCR方法。方法:分别针对HHV-6,-7,-8的U67、U36、ORF65基因设计3对引物和3种Taq Man-LNA探针,构建三重荧光定量PCR反应体系,用于同步扩增HHV-6,-7,-8。分别应用HHV-6,-7,-8质粒建立对应标准曲线,并对多重荧光定量PCR方法进行线性范围、灵敏度、特异性、重复性和扩增效率等方法学评价。以DNA测序法为参考方法,检测45例疑似HHV感染者外周血单个有核细胞(PBMC)中的HHV-6,-7,-8,对多重荧光定量PCR方法进行临床特异性和敏感性评估。结果:多重荧光定量PCR方法检测HHV-6,-7,-8的线性范围均在10⁶-106-10⁽¹¹⁾Copies/L,相关系数均>0.99,灵敏度为8×10(11)Copies/L,相关系数均>0.99,灵敏度为8×10⁵Copies/L,最低检测限为5×105Copies/L,最低检测限为5×10⁵Copies/L,无非特异性扩增,线性范围内HHV-6,-7,-8的批间、批内变异系数(CV)均<5.5%;与单重荧光定量PCR相比,检测HHV-6,-7,-8质粒含量的相关性分别为0.980,0.987,0.965。以DNA测序方法为金标准,多重荧光定量PCR检测HHV-6,-7,-8的特异性均为100%,灵敏度分别是93.1%、80%、100%。结论:多重荧光定量PCR能够对HHV-6,-7,-8进行同步、快速和准确的定量检测,将在输血安全筛查方面有着广泛的应用前景。     

隐匿性丙型肝炎病毒感染与慢性丙型肝炎的比较分析

目的:比较隐匿性丙型肝炎病毒(HCV)感染者与慢性丙型肝炎(CHC)患者的特点.方法:选择51例隐匿性HCV感染者和52例未经治疗的CHC患者,两组患者的年龄、性别、肝功能异常的持续时间相匹配,分别比较两组患者的肝功能指标和外周血单个核细胞(PBMCs)中的丙型肝炎病毒核酸(HCV RNA)含量.结果:CHC患者的天门冬氨酸转氨酶(AST)、丙氨酸转氨酶(ALT)、甲胎蛋白(AFP)显著高于隐匿性HCV感染者(P<0.01),而胆固醇(Ch)和甘油三酯(TG)则显著低于后者(P<0.01),γ谷氨酰转肽酶(GGT)在两组感染者中差异无显著性意义(P>0.05);CHC患者的PBMCs中HCV RNA平均含量显著高于隐匿性HCV感染者(P<0.01).结论:隐匿性HCV感染者病情严重程度不如CHC患者,这可能与其PBMCs中的病毒载量高低相关.     

四种消毒方法对医务人员手消毒效果观察

目的加强医护人员手卫生质量管理,提高手消毒效果。方法采用手消毒现场试验方法,对医院4种常用手消毒方法的消毒效果进行了比较。结果仅用肥皂流水洗手,再经84消毒液浸泡1min的医护人员手卫生合格率为90%;另外3组消毒处理后手卫生合格率均达到100%;所有消毒前手上菌数均超标。消毒前手上检出金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、绿脓假单胞菌、志贺菌等致病菌和条件致病菌;检出率比较高的有表皮葡萄球菌,金黄色葡萄球菌,大肠杆菌等,均超过13%以上。消毒后手上除2份标本检出大肠杆菌之外,未检出致病菌。结论所采用的4组手消毒方法,均可以达到良好的消毒效果。在日常工作中,医护人员操作前用常规肥皂流水洗手方法,结合常用消毒液浸泡或擦拭消毒均可达到较好的除菌效果。     

FQ-PCR技术在孕妇Ⅱ型单纯疱疹病毒感染中的应用

目的:探讨孕妇血清中Ⅱ型单纯疱疹病毒核酸(HSV 2-DNA)的数量与宫内感染率之间的关系。方法:采用荧光定量聚合酶链反应(FQ-PCR)方法对31例HSV 2-IgG阳性的晚期妊娠孕妇血清及其新生儿脐血HSV 2-DNA含量进行检测。结果:31例HSV 2-IgG阳性孕妇中有27例血清HSV 2-DNA阳性,含量为1.0×103~5.4×105copies/mL,新生儿脐血HSV 2-DNA阳性7例,宫内传播率为25.9%(7/27),7例发生新生儿宫内感染的孕妇血清HSV 2-DNA含量均>5.3×104copies/mL。结论:孕妇血清中HSV 2-DNA含量升高是胎儿发生Ⅱ型HSV感染的重要因素之一。FQ-PCR可以准确检测血清HSV 2-DNA的含量,提示体内复制和宫内感染情况,对于临床诊断与治疗有一定的指导意义。     

实时荧光定量聚合酶链反应检测乙肝病毒感染

定量PCR现已成为研究和临床诊断领域中的重要工具。然而,传统的方法如竞争性PCR和产物杂交法不仅费时、费力、增加污染机会,而且只能根据产物来定量,是终点定量法,其准确性难以把握。我们采用实时荧光定量聚合酶链反应(FQ-PCR)方法检测乙型肝炎病毒DNA(HBV-DNA),获得了很好的临床效果,报告如下。     

改良荧光定量PCR同步检测HBV-DNA含量及其熔解温度

目的通过改进荧光定量聚合酶链反应(FQ-PCR)的单荧光标记,建立灵敏、特异的HBV-DNA含量及其熔解温度(Tm)的同步检测方法。方法根据荧光标记物质的不同,将FQ-PCR分为TaqMan SYBR GreenI双标记(T S组)、TaqMan探针单标记(T组)和SYBR GreenI染料单标记(S组)三种,同时检测HBV-DNA已知浓度为108.48、105.70、103.70和<1×103.00(copies/ml)的血清中HBV-DNA含量及Tm,每组FQ-PCR检测每份血清时1次做5个平行管。结果T S组检测的HBV-DNA阳性血清均为阳性,其平均含量为108.55±0.32、105.79±0.29、103.81±0.30,与T组的108.49±0.31、105.69±0.30、103.72±0.25copies/ml对应浓度值取10对数比较,无统计学意义(t=0.31、0.54和0.27,P>0.05);与S组的108.41±0.35、105.21±0.34和103.26±0.26copies/ml(不含未检出的两次血清)比较,除高浓度外,中低浓度有统计学意义(t=2.90和2.62,P<0.05)。T S组和S组阳性血清均出现明显熔解曲线,Tm分别为71.8℃、72℃和79.8℃,阴性血清未出现扩增曲线和Tm值。T S组、T组和S组的灵敏度分别为102.70、102.70和103.00copies/ml。结论改良的SYBR GreenI和TaqMan探针双标记的FQ-PCR检测HBV-DNA时,兼有TaqMan探针标记FQ-PCR的灵敏度高、特异性强和SYBR GreenI标记FQ-PCR的Tm分析的优点,能达到同步检测HBV-DNA含量及其Tm的目的,为HBV-DNA含量及其多态性分析,尤其是为HBV-DNA含量及其基因分型同步检测提供了新思路。     

产妇血浆和新生儿尿液HCMV-DNA检测分析

目的了解产妇血浆、外周血单个核细胞(PBMC)和新生儿尿液中人巨细胞病毒核酸(HCMV-DNA)含量,并探讨其相关性。方法应用荧光定量聚合酶链反应(FQ-PCR)检测42例分娩了新生儿黄疸、早产儿和低出生体重儿的产妇血浆、PBMC及其新生儿尿液中HCMV-DNA的含量(观察组),同时检测36例正常新生儿尿液及其产妇血浆和PBMC中HCMV-DNA的含量(对照组)。结果观察组产妇血浆、PBMC和新生儿尿液中HCMV-DNA的阳性率分别为45.2%(19/42)、64.3(27/42)和61.9%(26/42),与对照组的阳性率5.6%(2/36)、11.1%(4/36)和8.3%(3/36)相比有统计学意义(χ2=15.5,P<0.01、χ2=22.9,P<0.01和χ2=25.2,P<0.01);观察组HCMV-DNA的平均含量(105.1±2.1)copies/ml(不含阴性)与对照组(104.4±1.4)copies/ml(不含阴性)相比(取10的对数)有统计学意义(t=1.70,P<0.05)。观察组26例产妇的PBMC与新生儿尿液中HCMV-DNA同时阳性时,两者HCMV-DNA含量呈正相关(r=0.758,P<0.01)。结论HCMV的感染与新生儿黄疸、早产和低体重患儿密切相关;新生儿尿液作为HCMV感染的检测标本,具有无创伤、易留取和真实反映体内感染情况的优点。     

双荧光标记定量PCR检测乙型肝炎病毒核酸

目的:探索SYBR GreenⅠ和TaqMan探针双标记荧光定量PCR(dFQ-PCR)检测乙型肝炎病毒核酸(HBV-DNA)的意义。方法:选择浓度为1011.70,108.70,106.70和<1×106.00copies/L的4种血清各1份,进行dFQ-PCR,同时以TaqMan探针和SYBR GreenⅠ单荧光标记PCR(sFQ-PCR)为对照,设置同一扩增和熔解曲线的循环参数,检测HBV-DNA含量及其熔解温度(Tm),每种方法一次检测每份血清5次。结果:dFQ-PCR检测的HBV-DNA阳性血的平均含量为1011.55±0.32,108.79±0.29,106.81±0.30,与TaqMan探针sFQ-PCR的1011.49±0.31,108.69±0.30,106.72±0.25copies/L对应浓度值取10对数比较,无统计学意义(t=0.31,0.54和0.27,均为P>0.05);与SYBRGreenⅠ染料sFQ-PCR的1011.41±0.35,108.21±0.34和106.26±0.26copies/L(不含未检出的两次血清)比较,中低浓度有统计学意义(t=2.90和2.62,P<0.05)。dFQ-PCR和SYBR GreenⅠ染料sFQ-PCR均出现明显熔解曲线,HBV-DNA含量为1011.70,108.70和106.70copies/L的Tm分别为79.8,71.8和72℃。结论:dFQ-PCR能同时检测HBV-DNA含量和Tm,为HBV含量及其基因分型的同步检测提供了新思路。     

自动采血枪采集末梢血易导致乙型肝炎病毒的交叉感染

目前,各级医院为缩短血糖、血氨等项目的检测时间,大量开展操作简便、报告快速、质量可靠的床边即刻试验。其所用工具有自动采血枪(PENLETⅡ),一般工作人员以此采集末梢血时不需培训即可容易地操作,且患者的疼痛感轻于手工扎针,因此被临床实验室和病房护士广泛使用。然而我们在操作中发现,当采血枪压住消毒后的皮肤,按下开关的瞬间,随着针头快速刺入皮肤并反弹时,患者的血液会飞溅到采血枪的笔     

丙型肝炎患者外周血单个核细胞中HCV-RNA含量检测的临床意义

目的:了解丙型肝炎(丙肝)患者外周血单个核细胞(PBMC)中丙肝病毒核酸(HCV-RNA)的存在情况并探讨其临床意义。方法:应用荧光定量聚合酶链反应(FQ-PCR)方法,对65例丙肝患者的血清和PBMC中HCV-RNA进行检测。结果:65例丙肝患者血清和PBMC中HCV-RNA阳性分别为41例(63.1%)和35例(53.8%),其中34例急性丙肝患者血清、PBMC中HCV-RNA阳性分别为21例(61.8%)、13例(38.2%),31例慢性丙肝患者血清、PBMC中HCV-RNA阳性分别为20例(64.5%)、22例(71.0%),慢性丙肝患者PBMC中HCV-RNA检出率与急性相比,差异有统计学意义(2χ=5.74,P<0.05)。3例(2例慢性、1例急性)丙肝患者PBMC中HCV-RNA阳性,但血清HCV-RNA阴性。9例(全为急性)丙肝患者PBMC中HCV-RNA阴性,但血清HCV-RNA阳性。32例(12例急性、20例慢性)丙肝患者血清和PBMC中HCV-RNA均阳性,且PBMC中HCV-RNA的含量均低于血清,两者含量呈正相关。结论:PBMC为HCV肝外贮存场所,其HCV含量依赖血清中HCV的含量;PBMC中HCV在丙肝患者的病情慢性化过程中可能起一定作用;实验室可以通过浓聚血液中PBMC的浓度来提高其HCV-RNA的检出率,故临床医生在对丙肝患者进行血清HCV-RNA定量检测的同时开展PBMC中HCV-RNA检测可以减少漏诊,可作为慢性丙肝患者的选择治疗及预后判断的重要指标。