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目的:建立截短的丙型肝炎病毒(HCV)核心蛋白的真核表达载体,并在中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中瞬时表达:方法:应用多聚酶链反应(PCR),以HCV-H株全长cDNA序列为模板,扩增获得C区羧基端部分缺失的基因片段,克隆人真核表达载体pcDNA3.1(-),并通过脂质体转染至CHO细胞。结果:构建了真核表达载体pcDNA3.1-Ct,成功转染CHO细胞,间接免疫荧光和RT-PCR证实pcDNA3.1-Ct在CHO细胞中表达截短型的C蛋白。结论:成功构建羧基端部分缺失的HCVC区基因的真核表达载体,瞬时转染CHO细胞,为进一步基因免疫和构建多表位卡介苗(BCG)活载体疫苗奠定基础。 相似文献
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HCV NS3蛋白单克隆抗体的制备及其识别区域的分析 总被引:2,自引:0,他引:2
目的 制备针对丙型肝炎病毒(HCV)非结构区NS3全长蛋白的单克隆抗体(MAb),并分析获得的单抗识别表位所在区域,为建立以NS3蛋白为靶位的抗HCV研究提供抗体工具。方法 用原核表达的HCV非结构区NS3全长蛋白作为免疫原,采用小鼠腹股沟皮下NC膜包埋法免疫小鼠,按常规杂交瘤细胞的制备方法,经细胞融合、克隆化制备抗NS3蛋白的MAb。用间接免疫荧光法和Westem blot鉴定其特异性。分别构建NS3丝氨酸蛋白酶(NS3蛋白的N末端1/3)编码基因的真核表达质粒pcDNA3.1(-)-ns3p、NS3解旋酶(NS3蛋白的C末端2/3)编码基因的真核表达质粒pcDNA3.1(-)-ns3A,将其瞬时转染COS-7细胞后,以获得的单克隆抗体作为一抗,通过免疫荧光分析获得单抗识别表位所在的区域。结果 获得了2株抗NS3蛋白的单克隆抗体,这2株MAbs均特异识别NS3蛋白,并确定了它们的结合区域。结论 获得了针对NS3蛋白的单克隆抗体,并对其单抗识别表位所在的区域进行了分析,为下一步进行以NS3蛋白为靶位的抗HCV研究奠定了良好的基础。 相似文献
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HCV复合多表位抗原基因的克隆表达及其免疫学特性分析 总被引:3,自引:1,他引:2
目的构建丙型肝病炎病毒(HCV)截短C基因和多表位基因重组原核表达质粒,表达纯化融合蛋白,分析其免疫原性和抗原性。方法PCR方法扩增核心区羧基端部分缺失的基因片段Ct;合成HCVE2区模拟表位与NS3~NS57个表位基因Em;分别将Ct、Em克隆人原核表达质粒pQE30,筛选阳性重组质粒pQE30-CtEm,转化E.coli M15,IPTG诱导融合蛋白表达,薄层扫描分析表达蛋白;可溶性分析后用Ni^2+-NTA凝胶亲和层析柱纯化、透析并浓缩融合蛋白;Westernblot分析纯化蛋白的特异性和抗原性;纯蛋白免疫小鼠后分析其免疫原性。结果成功构建了HCV复合多表位抗原基因的原核表达质粒pQE30-CtEm,目的基因可高效表达,表达产物主要以包涵体形式存在,Ni^2+-NTA纯化可获得目的蛋白,纯化蛋白具有良好的抗原性和免疫原性。结论HCV复合多表位抗原基因融合蛋白可高效表达并得到纯化,该融合蛋白可作为HCV诊断抗原,也为丙型肝炎新型疫苗的研究提供了靶抗原。 相似文献
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1 临床资料 2 0 0 0 - 11/ 2 0 0 1- 0 8发热有全身感染症状患者血液样本 30 2例 .一次性全封闭血培养瓶 ,采用 B- D公司BACTEC90 5 0系统专用瓶 .细菌鉴定及药敏用美国德灵公司Walk Away- 4 0全自动微生物细菌药敏试验鉴定仪 .美国德灵公司专用细菌和药敏试验鉴定卡 ,包括 PC11综合板 ,NC2 1综合板 .凡仪器报告为阳性瓶时 ,先做涂片、革兰染色镜检 ,根据涂片染色结果选定革兰阳性和革兰阴性鉴定板 ,取原液10μL ,直接上机做细菌鉴定和药敏试验 .将阳性培养瓶及时转种血琼脂、巧克力琼脂和麦康凯琼脂平板 ,经 35℃培养18~ 2 4 h形… 相似文献
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目的:纯化的HCV多中和抗原表位及HCV包膜蛋白E2嵌合的HBV S抗原病毒样颗粒免疫新西兰兔,测定免疫血清内的中和抗体。分析中和抗体对HCVpp感染Huh7.5的中和作用。方法:纯化的HCV多中和抗原表位及包膜蛋白E2嵌合的HBV S抗原病毒样颗粒(VLPs-MEp S、VLPs-E2S)10μg皮下接种新西兰兔,间隔2周共免疫3次,采集不同时间免疫兔血清,ELISA方法测定血清内的抗体,PBS组作为对照;制备1b型HCVpp,观察血清抗体对HCVpp感染Huh7.5的中和作用,对免疫血清保护性进行初步评价。结果:免疫后血清中产生一定水平的中和抗体,血清中和抗体测定VLPs-MEp S明显高于VLPs-E2S(P<0.05)。VLPs-MEp S与VLPs-E2S组均显著高于对照PBS组(P<0.01)。对HCVpp抑制作用,VLPs-MEp S高于VLPs-E2S组(P<0.05),最高中和率可达61.49%,二者均高于对照组(P<0.01)。结论:嵌合病毒样颗粒免疫新西兰兔后产生一定水平中和抗体,该中和抗体具有保护作用,为研发中和抗体表位疫苗奠定基础。 相似文献
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目的构建丙型肝炎病毒(HCV)HLA-A2限制性复合多表位基因的重组转移质粒pAdtrack-CMV-Ub-Mep,转染HEK293细胞,包装重组腺病毒rAd-Ub-Mep。方法复合表位Ub-Mep基因克隆到pAdTrack-CMV穿梭质粒,得到重组的穿梭质粒pAdtrack-CMV-Ub-Mep,将穿梭质粒pAdtrack-CMV-Ub-Mep和腺病毒骨架质粒pAdEasy1共转染HEK293细胞,产生重组腺病毒rAd-Ub-Mep,通过检测绿色荧光蛋白(GFP)的表达和PCR扩增目的基因的方法鉴定重组腺病毒,并测定重组腺病毒滴度。结果经酶切鉴定、PCR鉴定和荧光分析,均证实得到重组的腺病毒。测定病毒滴度为1.2×1011cfu/L。结论成功包装出重组腺病毒rAd-Ub-Mep,构建了HCV HLA-A2限制性多表位基因的重组腺病毒疫苗,为进一步研究HLA-A2限制性复合多表位基因诱导的细胞免疫应答奠定了基础。 相似文献
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目的 探讨汉滩病毒(HTNV)核蛋白羧基端多肽的抗原性,为建立分型检测方法奠定基础。方法 设计并合成S基因编码区及其3′端825bp片段引物,用PCR方法从PBV220-S22原核质粒中扩增出目的片段,应用TA克隆将其插入pcDNA3.1/V5-His-TOPO载体中,并通过脂质体转染至Vero细胞中进行瞬时表达,表达产物用间接免疫荧光法进行鉴定。结果 成功构建了pcDNA3.1-S及pcDNA3.1-S-C真核表达载体,间接免疫荧光法可检测到真核表达质粒转染的Vero细胞表达的核蛋白羧基端多肽。结论 pcDNA3.1-S及pcDNA3.1-S-C真核表达载体有较高的转染效率,能在宿主细胞中表达,为制备分型用核蛋白多肽抗原打下了基础。 相似文献
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目的建立乙型肝炎病毒(HCV)preS1基因与截短C基因真核表达载体,并在CHO细胞中瞬时表达。方法PCR方法扩增HBV核心区羧基端部分缺失的基因片段和preS1全基因,克隆入真核表达载体pcDNA3.1(-)后测序鉴定,并通过脂质体瞬时转染CHO细胞。结果构建了真核表达载体pcDNA3.1(-)-Ct-preS1,成功转染CHO细胞,间接免疫荧光和RT—PCR证实pcDNA3.1(-)-Ct-preS1在CHO中表达截短的核心基因和preS1基因融合蛋白。结论成功构建preS1基因与截短C基因真核表达载体,可在CHO细胞中瞬时表达,为深入研究HBV基因免疫奠定了基础。 相似文献