小鼠CXCR3基因转染细胞株的构建、鉴定及生物学功能研究

目的:构建含有小鼠CXCR3基因的重组逆转录病毒载体,获得稳定表达小鼠CXCR3分子的基因转染细胞株L929-mCXCR3,研究CXCR3与其配IP-10相互作用引起的L929-mCXCR3的迁移效应。方法:取1只雌性BALB/c小鼠(7周龄),尾静脉注射0.5mgConA/只,12h后取其脾脏,研磨成细胞悬液后,分离获得脾脏细胞;用含5万U/L人IL-2的RPMI1640培养基培养3d;收集细胞,TRIzol一步法抽提总RNA,RT-PCR扩增小鼠CXCR3全长基因,装入逆转录病毒载体pEGZ-term,与两辅助病毒载体脂质体法共转染包装细胞293T,收集含完整逆转录病毒颗粒的293T培养上清感染L929细胞,重复感染3次,筛选获得含Zeocin抗性的稳定表达小鼠CXCR3分子的基因转染细胞株。采用流式细胞术(FCM)和RT-PCR对CXCR3分子的表达进行鉴定。Transwell分析基因转染细胞株L929-mCXCR3在IP-10作用下的迁移能力。结果:构建了含小鼠CXCR3基因的重组逆转录病毒载体,建立了稳定表达小鼠CXCR3分子的基因转染细胞株L929-mCXCR3,其膜表面CXCR3分子阳性表达率为97.0%;该基因转染细胞株在IP-10的介导下可定向迁移,迁移率为4.356%。结论:L929-mCXCR3细胞株为研究CXCR3信号通路的生物学特性、肿瘤转移模型的建立和抗小鼠CXCR3单克隆抗体的研制奠定了基础。     

人可溶性OX40L蛋白ELISA检测试剂盒的研制及其在自身免疫性疾病诊断中的应用

目的研制特异性检测人可溶性OX40L蛋白（sOX40L）的ELISA试剂盒,探讨其在自身免疫性疾病临床诊断中的应用。方法利用两株识别不同抗原表位的鼠抗人OX40L单克隆抗体1G1和4C12分别作为包被抗体和检测抗体,采用双抗体酶联免疫夹心法研制特异性检测人sOX40L的ELISA方法,并对其稳定性、精确性和特异性进行分析。结果①建立的检测人sOX40L酶联免疫试剂盒在抗原浓度为3.91～250ng/ml范围内有良好的线性关系,并具有良好的稳定性、较高的准确性和特异性。②利用该ELISA方法检测到sOX40L蛋白在肾病综合征和Graves’病患者血清中表达水平均显著高于健康对照组。结论成功建立了检测人sOX40L蛋白的ELISA试剂盒,应用该方法检测到sOX40L在多种自身免疫病患者血清中异常高表达。该试剂盒在OX40L分子基础研究以及自身免疫病的临床诊断方面具有潜在的应用价值。     

AGEs对胰腺癌细胞株表面PD-L1表达的影响及生物学意义

目的研究糖基化终产物(AGEs)对人胰腺癌细胞株Patu8988表面程序性死亡配体1(PD-L1)表达的影响,探讨AGEs诱导的肿瘤细胞对T细胞增殖的作用。方法以糖基化牛血清白蛋白(AGE-BSA)干预细胞株Patu8988为实验组,以牛血清白蛋白(BSA)为对照组,孵育72h后用流式细胞术分析各组细胞表面PD-L1表达的变化;AGE-BSA诱导的Patu8988细胞与人T细胞共培养,72h后用细胞增殖和细胞计数试剂盒8(CCK-8)检测T细胞增殖。结果 AGE-BSA诱导72h后,Patu8988细胞表面PD-L1的表达呈浓度依赖性升高(P<0.05)。肿瘤细胞经AGEs诱导后抑制T细胞增殖能力增强(P<0.05),用抗PD-L1单抗阻断后抑制作用减弱(P<0.05)。结论 AGEs通过上调Patu8988细胞表面PD-L1的表达抑制T细胞增殖。     

Taqman探针定量检测ICOS/ICOSL基因表达的方法

背景:近年来可诱导共刺激分子(inducible costimulator,ICOS)/可诱导共刺激分子配体(ICOS Ligand,ICOSL)在抗感染、抗移植反应、抗肿瘤、治疗自身免疫性疾病等多方面领域受到了越来越多的关注.目前对ICOS/ICOSL表达量的研究大多基于分子水平,国内外尚鲜见ICOS/ICOSL mRNA定量检测的报道.目的:构建ICOS/ICOSL cDNA质粒标准品,建立Taqman探针检测 ICOSL/ICOSL基因表达量的方法.方法:以胃腺癌组织总RNA为模板、Random 9 mers为引物反转录合成cDNA,用该cDNA为模板聚合酶链反应扩增人ICOS/ICOSL 基因相应的cDNA目的片段,构建PMD-18-ICOS/ICOSL重组质粒,鉴定测序后,用Taqman探针实时荧光定量聚合酶链反应制作标准曲线.结果与结论:组织提取的总 RNA 完整性良好,构建的ICOS/ICOSL质粒测序结果与目的片段一致,质粒的原始浓度为6.10×1013,4.31x1013 copies/mL,倍比稀释后用Taqman探针荧光定量聚合酶链反应检测,在1012～1013 copies/mL线性关系良好(R2=1),提示成功建立了Taqman探针定量检测ICOS/ICOSL基因表达的方法.     

复发性生殖器疱疹患者血清可溶性PD-1的表达和免疫学意义

Objective To determine the concentration of soluble PD-1 (sPD-1) in the sera of patients with recurrent genital herpes (RCH), and to explore the significance of abnormal expression of sPD-1 in RCH. Methods Serum samples were obtained from 88 healthy blood donors, 74 patients with RCH including 34 cases of outbreak-stage RCH and 40 cases of stable-stage RCH. The serum level of sPD-1 was measured by monoclonal antibody labeling and enzyme linked immunosorbent assay (ELISA). Results A significant difference was observed in the serum level of sPD-1 between the patients with RGH and the blood donors (33.06 ± 17.5 μg/L vs. 53.07 ± 26.3μg/L, P < 0.01) and between the patients with outbreak-stage RGH and those with stable-stage RGH (27.47 ± 12.9 μg/L vs. 37.71 ± 19.6 μg/L, P< 0.01). Conclusions There is a low expression of sPD-1 in patients with RGH, which may be one of the mechanisms underlying the escape of HSV- Ⅱ from immunologic surveillance and development of immunological tolerance.     

gp130信号可上调神经前体细胞表面分子CXCR4的表达

gp130信号参与了神经前体细胞(NPC)的自我更新,敲除gp130分子的胚胎不能正常地发育,可导致胎儿在出生前夭折。CXCR4是趋化因子基质细胞源因子(stromalcellderivedfactor-1α,SDF-1α)已知的唯一受体,表达CXCR4的NPC可在体外被SDF-1α趋化而定向迁移,在神经功能缺损的修复中起着重要的作用。gp130和CXCR4分子之间可能存在着一定的相关性。本实验在发现NPC表达gp130和CXCR4的基础上,采用gp130激发型单克隆抗体激发NPC,结果表明能上调NPC表达CXCR4分子以及增强NPC的迁徙能力,从而揭示了gp130信号在胚胎NPC定向迁移中可能起着重要的作用。     

抗人CD28鼠-人嵌合抗体的构建及瞬时表达

目的构建及瞬时表达抗人CD28鼠-人嵌合抗体。方法采用基因工程技术,从分泌鼠抗人CD28单克隆抗体的杂交瘤细胞株（克隆号：2F5）中克隆出抗体重链和轻链可变区基因及相应信号肽编码序列。分别与人免疫球蛋白IgG1恒定区重、轻链基因拼接,构建含有重组基因的pIRES表达质粒pIRES/h2F5。转染293T细胞并用抗性药物G418选择培养。采用流式细胞术,检测瞬时转染细胞后嵌合抗体的表达情况。结果抗人CD28鼠人嵌合抗体得到表达并能与CD28分子特异性结合。结论抗人CD28鼠-人嵌合抗体的构建和瞬时表达是成功的,为后续构建稳定分泌抗人CD28鼠-人嵌合抗体的CHO基因转染细胞株奠定了基础。     

人共信号分子HVEM在外周血PBMC表达特性及其对T细胞的生物学作用

HVEM既可作为受体与LIGHT作用传递正性共刺激信号,又能作为配体作用于BTLA介导负性共抑制信号。为深入探讨HVEM对T细胞复杂而又独特的调控作用,本文研究了HVEM在免疫细胞上的表达特性,初步探讨了T细胞表达的HVEM分子所介导的生物学作用。采用LPS刺激人新鲜PBMC,以及PHA或PMA/IM刺激活化T细胞;间接免疫荧光标记和流式细胞术检测HVEM表达;MTT法分析T细胞增殖作用。结果显示,HVEM在不同条件刺激活化的T细胞表面均呈现先上调后下调表达;T细胞增殖试验表明,基因转染细胞L929/LIGHT能够明显促进T细胞的增殖及IL-2和IFN-γ的分泌,而以抗人BTLA单抗在一定程度上模拟HVEM所介导的BTLA/HVEM信号能够明显抑制T细胞增殖作用及细胞因子IL-2、IFN-γ和IL-10的产生。     

血红素加氧酶1分子克隆及表达载体的构建

背景：近年来许多研究发现血红素加氧酶1具有抗炎、抗氧化及抗凋亡等作用,并且在心肌缺血-再灌注损伤等应激反应中有重要的保护作用,从而成为研究热点。 目的：克隆大鼠血红素加氧酶1全长基因,并将其于真核表达载体PIRES2-EGFP相连接,构建血红素加氧酶1的真核表达载体。 设计、时间及地点：实验于2008-03/06在苏州大学生物技术研究所完成。 材料：成年雄性SD大鼠,由苏州大学动物实验中心提供,用于脾脏细胞总RNA的提取;克隆载体PMD18-T购自Takara公司;表达载体PIRES2-EGFP由苏州大学生物技术研究所保存。 方法：分离大鼠脾脏获取脾脏细胞,Trizol法提取脾脏细胞的总RNA,经反转录-聚合酶链反应扩增获得血红素加氧酶1基因,将扩增出来的产物与克隆载体PMD18-T连接,转化TOP10感受态细菌,挑取阳性克隆经PCR及酶切鉴定后测序确证。测序正确后抽提质粒作为模板进行PCR,Sal-Ⅰ和BamH-Ⅰ同时双酶切PCR产物和载体PIRES2-EGFP,再在T4 DNA连接酶的作用下进行连接,构建其真核表达载体。 主要观察指标：血红素加氧酶1基因的克隆和DNA测序结果证实序列是否正确;PIRES2-EGFP/血红素加氧酶1真核表达载体的构建以及测序证实目的基因成功插入载体。 结果：①实验完成了大鼠血红素加氧酶1基因的克隆,所获得的序列与GeneBank中收录的大鼠血红素加氧酶1序列完全一致。②构建真核表达载体PIRES2-EGFP/血红素加氧酶1,测序正确说明血红素加氧酶1基因成功插入表达载体PIRES2-EGFP中。 结论：实验成功克隆了大鼠血红素加氧酶1基因全长,并构建了其真核表达载体。