乙型肝炎病毒复制表达载体的构建与表达

目的构建乙型肝炎病毒(HBV)复制表达载体,验证其在HepG2细胞系中的复制和表达。方法通过引物设计合成,以实验室构建的HBV C1亚型质粒通过PCR、酶切、克隆等分子生物学技术,构建HBV复制表达载体。利用转染试剂(Fugene HD Transfection Reagent)将载体质粒导入HepG2细胞,分别检测乙型肝炎表面抗原(HBsAg)、乙型肝炎e抗原(HBeAg)和HBV DNA在不同时间点的表达。结果酶切和测序结果均证实载体构建成功,通过瞬时转染细胞证实培养上清液中可检测到HBsAg、HBeAg和HBV DNA。结论利用分子克隆技术成功构建了HBV复制表达载体,可以在HepG2细胞系中复制表达。通过进一步改造,可以为HBV表型耐药以及复制活性研究提供支持。     

增强型绿色荧光蛋白-神经标识真核表达载体构建及在细胞内的表达

目的 构建可转染神经胶质细胞和神经元的增强型绿色荧光蛋白-神经标识(EGFP-ID)真核表达载体,为神经突起损伤活体研究提供技术方法. 方法 采用PCR方法分别从质粒pEGFP-N1载体和大鼠脑组织基因组DNA中扩增EGFP和ID序列.通过T4 DNA连接酶将纯化后的PCR产物EGFP与经过BamH Ⅰ和EcoR Ⅰ双酶切的pcDNA4.1-hisB载体连接.将经克隆测序确定的pcDNA4.1-EGFP经由NotⅠ和Xba Ⅰ双酶切并与纯化的PCR产物ID连接,再次克隆测序确定为pcDNA4.1-EGFP-ID.将pcDNA4.1-EGFP与pcDNA4.1-EGFP-ID在转染试剂Fugene6 介导下转染人神经胶质瘤U87细胞和小鼠原代培养神经元,通过倒置荧光显微镜观察EGFP在2种细胞内的分布.此外,用50 μmol/L核苷类似物司他夫定处理神经元8d,第8天末观察EGFP-ID 示踪细胞突起发育情况,并与免疫荧光检测结果作比较. 结果 成功扩增得到EGFP和ID基因片段,重组得到EGFP-ID真核表达载体,该载体携带的EGFP基因在U87细胞和神经元内表达并布满细胞突起,示踪神经元突起形态变化的结果与免疫荧光观察结果一致. 结论 pcDNA4.1-EGFP-ID能够介导EGFP基因在神经元和胶质细胞突起内表达,从而直观再现神经突起形态特征.     

现代传染病专科医院发展的思考

传染病专科医院定点收治传染病在我国重大传染病防治中发挥着重要作用。但是,长期形成的传染病隔离治疗体系,其在隔离传染源的同时,也在患者和社会之间形成了一定的心理隔阂。同时,在传染病专科医院与综合医院之间也形成了一定程度的理念、信息、资源上的不对称。这对传染病患者融入社会以及传染病的及时发现和有效防治产生了一定的不利影响。因此,有必要通过改变观念、医疗资源整合和内涵建设促进传染病专科医院发展,为传染病患者提供更为高效、优质的医疗服务。     

实时荧光定量PCR检测HIV-1逆转录酶活性方法的建立

目的 体外模拟HIV-1的逆转录起始过程,建立实时荧光定量PCR测定HIV-1逆转录(RT)酶活性的方法.方法 以人类基因组DNA为模板PCR扩增得到tRNALys+3基因,在其5'端加入T7转录启动子,应用T7 RNA聚合酶转录得到cRNA;以HIV-1感染性克隆为模板PCR扩增得到HIV的5'-LTR-PBS,将其克隆连接至pGEM-T easy载体上,利用SP6 RNA聚合酶转录得到SP6-5'-LTR-PBScRNA;分别应用两种标准RT酶(SuperScript Ⅲ和HIV-1标准RT酶)催化体外逆转录反应合成相应cDNA.实时荧光定量PCR法检测底物cDNA模板量,进而得出逆转录酶的相对活性.结果 成功获得长度为93 bp的tRNALys-3引物和872 bp的SP6-5'-LTR-PBS RNA模板.将SuperScriptⅢ和HIV-1标准RT酶分别按1:10、1:100、1:1 000、1:10 000比例稀释后催化逆转录反应,实时荧光定量PCR分析所得的逆转录产物cDNA,其循环阈值分别为13.9、18.3、20.9、24.9和20.4、25.5、28.7、32.5.结论 成功模拟HIV-1逆转录的起始过程并建立了基于实时荧光定量PCR检测RT酶活性的新型方法,为临床治疗、新药筛选和耐药检测提供了参考指标.     

中药内服结合熏蒸治疗腰椎术后腰痛

目的:中药熏蒸结合内服治疗腰椎术后腰痛的临床观察。方法:2003年5月到2006年12月收治腰椎手术患者198例,并分为有骨折组82例(包括椎体骨折、椎体滑脱行内固定者)和无骨折组116例(包括腰椎间盘突出症、椎管狭窄)。随机分为中药熏蒸结合腰痛康方内服治疗组(简称:中药组)115例和芬必得组83例,分别于术后2周、2月、3月采用口述分级评分法(VRS)和Denis疼痛等级分类法进行评定,并对两组间行x2检验。结果:中药组治愈率远较芬必得组高,经统计学处理具有显著差异(P<0.05)。可以看出中药组的远期疗效较芬必得组明显占优。结论:本研究从临床角度证明腰痛康结合中药熏蒸具有确切可靠的治疗效果,并提出中医药治疗的适应症。     

应用带角度椎弓根螺钉系统治疗腰椎滑脱（附14例报告）

由角度椎弓根螺钉与螺杆组成的角度椎弓根螺钉系统,称为RF系统(Reduction Fixation,RF)。其角度螺钉有0°、5°、10°、15°四种,根据需要组合起来,可获得脊椎生理弯曲所需要的基本角。临床显示其性能优于AO(Dick)系统和Steffee系统,我科应用该系统治疗腰椎滑脱14例,取得满意疗效,现报告如下。     

异体胎儿骨在脊柱侧弯矫治中的应用

在脊柱侧弯畸形的矫治中，要达到持久的矫形与稳定，必须有坚强的植骨融合。自体骨是理想的植骨材料，但来源常会遇到困难[1-3]，且随着取骨量增加，并发症相应增加[1，2，4]。自1986年～1993年，我科采用经酒精储存的同种异体胎儿骨进行脊柱矫形融合，经24例病人的随访观察，取得了满意的疗效。总结如下。1临床资料自1986年6月～1993年IO月，在24例脊柱侧弯矫治术中，联合应用了自体骨和同种异体胎儿骨移植。其中麻痹性侧弯患者19例，年龄11～33岁，平均19．8岁，采用改良Drum－mond手术十后侧植骨；先天性侧弯患者5例，年龄8～24岁，平…     

转导野生型pt3基因提高K562细胞对紫外线诱导的细胞凋亡的 …

观察野生型ｐ５３基因转染的Ｋ５６２细胞对紫外线诱导其细胞凋亡的影响。方法应用基因转转染技术将重组重生型Ｐ５３的逆转录病毒载体转导Ｐ５３蛋白缺失的Ｋ５６２细胞，用紫外线照射Ｋ５６２－Ｐ５３细胞不同的后再培养不同时间，用ＤＮＡ片段化和细胞ＤＮＡ     

短期使用齐多夫定抑制p53R2表达及诱导小鼠神经元凋亡的研究

目的探讨齐多夫定(AZT)的中枢神经毒性及其相关机制。方法原代培养小鼠大脑皮层神经元,分别用0 mmol/L、50 mmol/L、100 mmol/L的AZT作用于细胞,TUNEL法检测细胞凋亡,免疫荧光观察细胞形态,实时定量PCR(qPCR)检测依赖p53的p53R2、抑癌基因p21、胸苷激酶(TK2)mRNA表达及线粒体DNA含量,蛋白印迹检测p53R2与p21蛋白的表达。结果 AZT 0mmol/L组(对照组)、50 mmol/L组和100 mmol/L组细胞凋亡率分别为(11.9±3.37)%、(24.3±8.94)%和(54.7±17.9)%,差异具有统计学意义(χ2=5.19、19.33,P均0.01);突起长度分别为(869.21±177.75)mm、(495.76±175.20)mm和(120.38±47.12)mm,且差异均具有统计学意义(F=19.558,P=0.002);real-time qPCR检测结果显示AZT 50 mmol/L和100 mmol/L组p53R2、TK2 mRNA拷贝数分别是对照组的0.42和0.04倍、0.52和0.29倍,组间差异均具有统计学意义(Z=-4.54、-6.65、-4.33和-5.24,P均0.01);AZT 50 mmol/L和100 mmol/L组p21 mRNA拷贝数分别是对照组的0.98和0.86倍,差异无统计学意义(P0.05)。线粒体含量用环氧化酶2(COX-2)拷贝数评估,AZT 50 mmol/L组和100 mmol/L组分别是对照组的0.92和0.87倍,差异无统计学意义(P0.05)。蛋白印迹显示对照组、AZT 50 mmol/L组和100 mmol/L组p53R2蛋白含量依次降低,而p21蛋白含量无差异。结论 AZT可诱导神经元凋亡,抑制突起形成,推测其机制与p53R2表达降低有关。短期接触AZT可抑制TK2的表达,但对线粒体DNA含量无影响。