IL-18、TNFα在脂多糖介导的急性肝坏死发生中的作用研究

目的探讨IL-18、TNFα在急性肝损伤中的作用.方法采用D-氨基半乳糖(D-Gal)900mg/kg与脂多糖(LPS)10μg/kg诱导BALB/C小鼠急性肝坏死动物模型,腹腔内注入D-Gal/LPS后0～9h分别检测血清转氨酶(ALT、AST)、肝组织病理、DNA梯形条带,评估肝损伤情况;用半定量RT-PCR和相应的分析软件分析不同时间点肝组织中IL-18 mRNA、TNFαmRNA表达及ELISA试剂盒检测血浆IL-18、TNFα的蛋白表达.结果D-Gal/LPS给予后4h血清转氨酶明显升高,7h小鼠开始死亡,10h死亡率达80%.肝组织病理学检查发现,5h肝窦扩张、炎性细胞浸润、库普弗细胞增生;7h肝细胞大量凋亡、坏死或肝组织出现大量出血性坏死;5h电镜示肝细胞核仁碎裂、线粒体肿胀或空泡变性;7h核仁边聚,呈半月型,表现为典型的凋亡形态学变化,线粒体大部分空泡变性.DNA电泳显示5h始出现梯形条带.正常情况下肝组织IL-18 mRNA少量表达,经D-Gal/LPS诱导后小鼠肝组织IL-18 mRNA表达量明显增加,表达高峰在LPS刺激后1～2h(与0h比较,P＜0.01);正常情况下肝组织TNFα mRNA不表达或呈微弱表达,但在该模型诱导过程中肝组织TNFα mRNA有不同程度的表达,且其表达的时间模式与IL-18 mRNA不同,TNFα mRNA表达高峰见于LPS刺激后2h和5h(与0h比较,P＜0.01).血浆IL-18、TNFα蛋白表达也与mRNA表达一致.结论本实验诱导的急性肝坏死模型中,肝细胞凋亡和坏死同时存在,在肝细胞坏死的发生过程中细胞因子IL-18 mRNA、TNFα mRNA及其蛋白在肝内的表达量明显增多,其变化早于转氨酶指标和组织学变化,而且在LPS刺激后IL-18 mRNA的表达先于TNFαmRNA,提示IL-18、TNFα均参与了此型肝损伤,且IL-18可能是TNFα的上游细胞因子.     

牛磺酸熊脱氧胆酸对细胞色素C介导HepG2细胞凋亡的作用

目的 探讨牛磺酸熊脱氧胆酸(TUDCA)对牛磺酸脱氧胆酸(TDCA)诱导HepG2细胞凋亡阻抑作用及分子机制。 方法 应用Hoechst 3325 8染色、电镜和DNA电泳对细胞凋亡进行定性;应用流式细胞仪对凋亡细胞进行定量;检测TDCA单独孵育及与TUDCA共孵育时,胞浆中细胞色素C含量及Caspase-3、8、9蛋白酶活性的变化。 结果 TDCA 400μmol/L孵育12 h可诱导显著HepG2细胞凋亡,凋亡率为(50.35±2.20)％,细胞经TUDCA与TDCA共孵育后,细胞凋亡率明显下降,为(13.78±0.84)％;TUDCA能显著抑制TDCA引起的细胞色素C释放及Caspase-9、3蛋白酶活性升高,孵育12 h时,Caspase-3活性分别下降54.9％(t=16.88,P<0.01)和52.5％(t≥13.00,P<0.01),轻度降低Caspase-8活性升高,活性下降24.5％(t=1.94,P>0.05)。结论 稳定线粒体膜、阻止细胞色素C释放及随后Caspase-9、Caspase-3活化,是TUDCA抗凋亡的主要机制。抗凋亡作用可能是TUDCA治疗胆汁淤积性肝病取得显著疗效的重要机制之一。     

Toll样受体4在D-氨基半乳糖/内毒素介导的急性肝损伤中的表达

目的研究D-氨基半乳糖(D-Gal)/内毒素介导的急性肝损伤模型中肝组织细胞Toll样受体4(TLR4)的表达变化,探讨TLR4在识别内毒素、启动炎性肝损伤中的作用.方法 BALB/C小鼠腹内注射D-Gal 900 mg/kg与内毒素(即脂多糖,LPS)10 μg/kg后0～7 h分别检测血清丙氨酸转氨酶(ALT)及天门冬氨酸转氨酶(AST)与血浆肿瘤坏死因子(TNF-α)含量以评价肝功能;另随机取10只小鼠给药后观察致死率.用半定量逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)和Tanon Gis 2.0软件分析不同时间点肝组织中TLR4 mRNA表达,并与血浆TNF-α含量进行相关分析;免疫组织化学观察肝组织TLR4蛋白的表达.实验数据用SAS软件分析.结果给药后4 h,血清转氨酶明显升高(与0h比较,P＜0.05);血浆TNF-α含量逐步上升,在2 h、5 h有两个分泌高峰;7 h小鼠开始死亡,10 h致死率达80%.正常小鼠肝组织少量表达TLR4 mRNA,给药后表达明显增强(与0 h比较,P＜0.05);免疫组织化学也显示TLR4蛋白有类似的变化,尤其肝窦内皮细胞、库普弗细胞表达更为显著.血浆TNF-α含量与肝组织TLR4 mRNA表达呈正相关.结论肝内细胞膜上表达的TLR4可能通过启动下游的炎性应答基因表达及细胞因子释放而诱导出肝组织对LPS的炎性应答.因此,调控TLR4表达可能是感染性疾病防治的一种新策略.     

生长因子及细胞外基质对肝前体细胞体外增殖及分化的影响

目的 明确多种生长因子对胚胎肝脏前体细胞体外增殖分化的影响。方法 用胶原酶从胎龄14．5d SD大鼠胚胎肝脏分离单个细胞，采用^3H-TdR掺入法检测生长因子对胎肝细胞体外增殖的促进作用，并观察生长因子及细胞外基质成分对胎肝干细胞集落形成的影响。采用免疫细胞双标记及G-6-P酶活性测定以检测肝前体细胞表面标记的表达及向成熟肝细胞的分化能力。结果 肝前体细胞在体外培养时显示克隆样生长的特性。促肝细胞生长因子(HGF)、表皮生长因子(EGF)能促进肝前体细胞的增殖，使DNA合成加速，并促进干细胞集落的形成及角蛋白19、白蛋白、G-6-P的表达。转化生长因子α对肝前体细胞的促增殖作用较弱。转化生长因子β对肝前体细胞的增殖起到抑制作用。细胞基质成分Ⅰ型胶原、Ⅳ型胶原、层黏连蛋白能促进肝干细胞集落的形成，而纤维连接蛋白的作用较弱。肝干细胞单克隆增殖需要生长因子及细胞外基质的共同参与，加入新鲜分离胎肝细胞培养液上清液时单细胞增殖较快，于第5天即形成细胞集落。结论 HGF、EGF对肝前体细胞的增殖分化起重要作用，细胞外基质成分亦参与了其增殖分化过程。肝干细胞单克隆培养除需生长因子和细胞外基质外，可能亦有某些造血细胞、间质细胞分泌的因子参与其增殖分化的调控。     

e抗原阳性慢性乙型肝炎患者外周血树突状细胞Toll样受体3的表达及意义

目的探讨Toll样受体3（TLR3）的表达与HBV感染后宿主免疫清除障碍的关系。方法选取轻度CHB患者50例,健康对照者48名,其外周血用免疫磁珠细胞分选法获得纯化的CD14^＋单核细胞,用RPMI 1640培养基培养,并且用人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子和hIL-4诱导单核细胞成为未成熟的髓样树突状细胞（mDC）,加入聚肌胞刺激后获得成熟的mDC。分别在剌激后0、12、24、48h用流式细胞仪检测TLR3、CD86、HLA-DR和CD1a的表达,实时PCR检测TLR3的表达变化。结果健康对照组中mDC在刺激后24h,TLR3表达较0 h时上调显著（P〈0.05）,48h时TLR3的表达与0h相比差异无统计学意义（P〉0.05）;患者组在刺激后12、24h TLR3的表达与0h时相比,上调不明显,48h时TLR3的表达显著上调（P〈0.05）。实时PCR检测mDC上TLR3 mRNA结果发现,对照组TLR3 mRNA在刺激后12h的表达水平较0h显著上升（P〈0.05）,也显著高于患者组刺激后0、12、24h的表达水平;患者组刺激后48h的TLR3 mRNA表达水平较0h显著上升（P〈0.05）。与0h比较,健康对照组在刺激后12、24h和48h,CD86的表达水平显著高于患者组（P〈0.05）。患者组与对照组间CD1a和HLA-DR的表达差异无统计学意义。结论慢性HBV感染者mDC受聚肌胞刺激后TLR3表达异常,协同刺激因子CD86表达低下,可能造成宿主对HBV感染的免疫清除障碍,导致疾病慢性化。     

小鼠半胱天冬酶-12特异性小干扰RNA真核表达载体的构建及鉴定

目的 构建小鼠半胱天冬氨酸蛋白酶-12（Caspase-12）基因特异性小干扰RNA（siRNA）表达载体并检测其表达。方法 参照siRNA模板设计原则，设计并合成3对针对caspase-12不同位点的siRNA，分别在脂质体介导下转染小鼠肝癌细胞株Hepal-6，24h收集细胞；RT-PCR分析不同位点siRNA对靶基因mRNA表达的抑制，筛选出抑制效率最高的位点；将此位点siRNA模板序列插入质粒pRNAT-H1．1Neo中，PCR分析及基因测序进行鉴定；构建成功的重组质粒转染Hepal-6细胞48h和72h后，实时荧光定量PCR分析caspase-12 mRNA表达；Western印迹检测Caspase-12的表达。数据行t检验。结果 RT-PCR分析表明，第-对siRNA（siRNA＊1）对caspase-12基因表达的抑制效率最高；重组质粒pRNAT-H1．1Neo-caspasel2（pRNAT-caspl2）经PCR分析及测序表明，siRNA＊1模板序列成功插入预计位点，且序列正确；pRNAT-caspl2转染Hepal-6细胞48h和72h后，与空质粒对照组相比，caspase-12 mRNA水平分别下降72．5％和59．5％（P〈0．05）；pRNAT-caspl2转染后，caspase-12酶原表达量在24、48和72h分别下调17．1％、37．3％和60．1％，48h和72h的抑制率比较，差异有统计学意义（P〈0．05）。结论 成功构建小鼠caspase-12特异性siRNA真核表达载体，它对小鼠肝癌细胞caspase-12基因的表达具有显著和特异的抑制作用。     

丙氨酸氨基转移酶持续正常的慢性乙型肝炎病毒感染者的肝脏组织学改变

目的探讨ALT水平持续正常的慢性HBV感染者的肝脏组织学的炎症分级和纤维化分期,并分析肝脏组织学改变的相关因素。方法选择2003年10月-2007年2月瑞金医院感染科住院经肝活组织检查的139例ALT水平持续正常的慢性HBV感染者。ALT水平持续正常定义为肝活组织检查前至少1年内连续随访3次以上,每次间隔2个月以上,血清ALT均在正常范围、且可检测到HBV的慢性HBV感染者(A组)与同期行肝活组织检查的135例未曾抗病毒治疗过的ALT异常的HBV感染者(B组)进行肝脏组织学特征比较。结果A组中66例(47.5%)患者肝组织正常,但仍有33例(23.7%)肝脏显著组织学改变,有13例(9.4%)患者已发展到肝硬化阶段。与(0～0.75)×正常值上限(ULN)ALT亚组相比,(0.76～1.00)×ULN ALT亚组存在更高比例的肝脏显著组织学改变(43.5%对比19.8%,x~2=5.930,P<0.05),与年龄<40岁者相比,年龄>40岁的A组患者发生肝脏显著组织学改变者的比例明显增高,无论病毒载量或e抗原状态都不能预测其肝脏显著组织学改变程度。结论无论病毒载量高低、e抗原状态如何,23.7%的持续ALT正常的慢性HBV感染者存在着显著肝脏组织学改变。对可检测到病毒载量的持续ALT正常的慢性HBV感染患者应考虑进行肝脏活检,特别是年龄>40岁且ALT在(0.76～1.00)×ULN者。     

民强国富相促进 国泰民安要健康——谈初级卫生保健的伟大意义

300多年前,英国政治算术派经济学家威廉。配蒂指出:政府增加1倍的预防经费,国家可减少近9/10的健康经济损失。这是民强国富思想的萌芽。WHO 在1984年 A37号文件中指出:“过去10年被认识到的第一个基本真理是:正如发展(社会经济)     

SARS防制策略实证分析--突发公共卫生事件防制策略研究之一

通过对SARS发病的基本情况、特点、传播途径、地区人群分布及相关社会因素的流行病学分析，提出SARS的防制策略：建立突发公共卫生事件应急机制；掌握SARS流行规律，控制疫情蔓延；加强流动人口管理及提高农村防制能力；树立长期与SARS作战的思想；依靠科学，依法防制。     

健康城市——跨世纪的健康选择

健康城市,是一个崭新的概念。城市是国家政治、经济、文化的中心,在社会经济发展中具有重要的战略地位。然而,城市化和城市人口剧增这一全球现象带来了的众多的对人类健康有害的因素,使城市居民生存环境日趋恶化。1996年世界卫生组织确定世界卫生日(4