pNTAP-PRAK真核表达载体的构建及其在HEK293细胞中的表达

目的: 构建pNTAP-PRAK真核表达质粒,并建立其稳定表达的HEK293细胞系。方法: 将人的PRAK亚克隆至串联亲和纯化(tandem affinity purification, TAP)载体pNTAP质粒上,构建成重组质粒pNTAP-PRAK,转化该重组质粒至感受态大肠杆菌DH5α,阳性克隆进行PCR、酶切及DNA测序验证正确后,利用PolyFect脂质体介导将其转染至HEK293细胞中,再通过G418筛选建立稳定表达TAP tag-PRAK融合蛋白的HEK293细胞系;利用Western blotting和细胞免疫荧光标记法检测融合蛋白TAP tag-PRAK的表达及细胞内定位情况。结果: 重组真核表达载体构建正确,该重组质粒能在HEK293细胞中稳定表达,表达产物TAP tag-PRAK主要分布在核内。结论: 成功构建pNTAP-PRAK真核表达载体并建立了其稳定表达的HEK293细胞系,TAP标签未对PRAK定位产生明显影响。     

内毒素休克小鼠肝血管靶向性结合肽的初步研究

目的研究肽CLTTWAPAC与内毒素休克BALB/c小鼠肝血管的靶向性结合作用。方法构建pET14b-SBP和pET14b-SBP-CLTTWAPAC原核表达载体,转化大肠埃希菌BL21(DE3),诱导表达纯化蛋白SBP和SBP-CLTTWAPAC。建立内毒素休克小鼠模型,将9只内毒素休克BALB/c小鼠随机均分为3组:①PBS对照组(经尾静脉先后注射灭活空噬菌体、PBS和噬菌体CLTTWAPAC,间隔5min);②SBP对照组(经尾静脉先后注射灭活空噬菌体、SBP和噬菌体CLTTWAPAC,间隔5min);③SBP-CLT-TWAPAC组(经尾静脉先后注射灭活空噬菌体、SBP-CLTTWAPAC和噬菌体CLTTWAPAC,间隔5min)。小鼠左心室灌流后取肝匀浆称重,行噬菌体计数,计算各组肝噬菌体单位重量滴度。结果 PBS对照组与SBP对照组肝噬菌体单位重量滴度差异无统计学意义(435185±57824pfu/gvs468290±74106pfu/g,P0.05),而SBP-CLTTWAPAC组肝噬菌体单位重量滴度(176059±98506pfu/g)显著降低,与两对照组比较差异均有统计学意义(P0.05)。结论 CLTTWAPAC可竞争性抑制噬菌体CLTTWAPAC与内毒素休克小鼠肝血管的结合,进一步证明CLTTWAPAC靶向性结合于内毒素休克小鼠肝血管。     

具有细胞穿透功能的串联亲和层析分离载体的构建与功能鉴定

目的建立基于抗生蛋白链菌素结合肽(SBP)-钙调蛋白结合肽(CBP)分离标签以及细胞穿透肽转录反式激活因子(TAT)和绿色荧光蛋白(GFP)原核表达系统的、具有细胞穿透功能的原核串联亲和层析分离系统。方法应用PCR方法,以pEG-FP-C2载体为模板扩增EGFP序列,以pNTAP载体为模板扩增CBP-SBP序列,采用退火方法得到TAT片段,采用常规酶切、连接方法将EGFP、CBP-SBP和TAT片段依次克隆入pET14b-MCStop载体中,酶切、PCR和测序鉴定无误后,得到pET14b-CBP-SBP-EGFP-TAT重组质粒。将重组质粒转化BL21(DE3)大肠埃希菌,以IPTG诱导融合蛋白表达,利用Ni2+-NTA亲和层析纯化获得融合蛋白,将不同浓度的融合蛋白加入培养的人肝癌细胞株(HepG2)检测融合蛋白的穿细胞膜功能。结果所构建的pET14b-MCS-CBP-SBP-EGFP-TAT融合蛋白表达载体正确,该载体可在大肠埃希菌内高效表达,用Ni2+-NTA纯化获得了相对分子量约40kD的目的融合蛋白。细胞功能实验结果表明融合蛋白能够穿越细胞膜,且具有浓度依赖性。结论成功构建了pET14b-MCS-CB...     

趋化因子CXCL16在胃癌中的表达及其临床病理学意义

目的:研究趋化因子CXCL16在胃癌和正常黏膜中的表达情况及其关系,从而探讨CXCL16在胃癌发生、发展中的作用及临床意义。方法:收集术中新鲜胃癌组织及对应的正常黏膜,进行免疫组化和RT-PCR实验检测CXCL16蛋白和mRNA水平。其表达情况与各项临床病理学指标进行对比分析,同时进行生存分析。结果:CXCL16在28例新鲜标本中,胃癌组织中CXCL16的水平明显高于癌旁正常组织。免疫组化显示CXCL16主要表达于胃癌细胞、固有腺体和浸润炎性细胞的细胞核内。通过与临床病理学指标比较显示,CXCL16的核表达与浸润深度、淋巴管浸润和UICC分期密切相关,并提示良好预后。结论:CXCL16可能参与胃癌的发生发展,其组织中的表达水平能够提示胃癌细胞的生物学行为和胃癌患者的预后。     

刘中勇教授“舌下络脉诊法”从浊辨证经验

舌下络脉诊法是中医舌诊的重要组成部分,刘中勇教授认为舌下络脉可以反映人体浊瘀状况,通过"舌下络脉诊法"可以有效的判定体内病理性的浊瘀程度,对于临床疾病的诊断以及疾病的预后观察具有重要的指导意义。     

手足口病危险因素的meta分析

目的探讨手足口病发病的危险因素,为其防治提供科学依据。方法采用Stata11．0软件,对我国现有已报道的手足口病发病危险因素的病例对照研究资料进行meta分析。结果近1周有手足口病接触史、公共场所暴露史、共用玩具接触史,饮用生水,居住在农村为危险因素。饭前便后洗手为保护因素。结论影响手足口病发病的因素较多,应从多方面进行预防控制。     

高效液相色谱法同时测定纯阳正气胶囊中3种成分的含量

目的 采用高效液相色谱法建立同时测定纯阳正气胶囊中橙皮苷、桂皮醛和丁香酚含量的方法。方法 色谱柱为Agilent PorosheⅡ120 EC-C₁₈(4.6 mm×150 mm,4μm),以乙腈-水为流动相梯度洗脱,柱温35℃,流速1.0 ml/min,检测波长284 nm。结果 方法学验证表明,橙皮苷、桂皮醛和丁香酚3种成分线性关系良好(r≥0.999 9),精密度小于2.0%,平均加样回收率在98.0%～101.9%之间,稳定性和重复性的RSD均<3.0%,符合方法学要求。结论 该方法简便、稳定、重复性好、准确可靠,可用于纯阳正气胶囊的质量控制。     

单鼻腔切口半面翻揭术与鼻侧切开术的比较分析

目的:探讨单鼻腔切口的半面翻揭术与鼻侧切开术两种进路联合鼻内镜治疗鼻腔鼻窦肿瘤病变的优缺点.方法:单鼻腔切口半面翻揭联合鼻内镜手术32例作为观察组,其中恶性肿瘤13例,乳头状瘤9例,其他良性肿瘤10例;鼻侧切开术联合鼻内镜手术30例作为对照组,其中恶性肿瘤13例,乳头状瘤7例,其他良性肿瘤10例;比较两组的手术时间、出血量以及疗效.结果:两组术野暴露范围无明显差异,手术时间比较差异无显著性,手术出血量差异有显著性,观察组少于对照组;两组术后复发率差异无显著性,对照组所有面部均遗留术后切口瘢痕.结论:单鼻腔切口半面翻揭径路联合鼻内镜手术治疗选择性的单侧鼻腔鼻窦肿瘤不遗留面部瘢痕、出血减少,术野暴露及手术效果与鼻侧切开雷同,可替代鼻侧切开手术.     

p38调节活化蛋白激酶绿色荧光蛋白融合载体的构建及表达

目的 构建在哺乳动物细胞中表达的PRAK绿色荧光蛋白融合表达载体。方法 将克隆在pET-14b上的PRAK亚克隆到绿色荧光蛋白载体pEGFP-C2上,随后转染Hela细胞,并在荧光显微镜下观察。结果 重组质粒经酶切、PCR和测序鉴定正确无误,并在Hela细胞中得到高量表达。融合蛋白发出的绿色荧光表明EGFP-PRAK主要分布在细胞核中。结论 成功构建了PRAK绿色荧光蛋白融合载体,该载体能在哺乳动物细胞中进行表达,为研究PRAK的细胞内定位和移位提供了一个重要的工具。     

人晚期糖基化终产物受体胞质内段融合蛋白表达载体的构建与表达

目的构建人晚期糖基化终产物受体胞质内段(hRAGE-C)GST融合蛋白的重组原核基因表达载体并进行表达与纯化,研究其功能并鉴定与其相互作用的蛋白。方法采用PCR方法扩增hRAGE基因编码区的胞质内段,并将其重组于pGEX-KG载体中。重组质粒经PCR、酶切、序列鉴定分析后,转化大肠杆菌BL21,以异丙基β-D硫代半乳糖(IPTG)诱导产生hRAGE胞质内段的GST融合蛋白。结果PCR、酶切和测序结果表明所克隆的GST/hRAGE-C原核表达载体完全正确,继而表达、纯化获得了相对分子质量约35 000的融合蛋白(符合预期大小)。结论将hRAGE胞质内段构建于含有GST标记的载体上并获得融合蛋白的高效表达。