刘中勇教授“舌下络脉诊法”从浊辨证经验

舌下络脉诊法是中医舌诊的重要组成部分,刘中勇教授认为舌下络脉可以反映人体浊瘀状况,通过"舌下络脉诊法"可以有效的判定体内病理性的浊瘀程度,对于临床疾病的诊断以及疾病的预后观察具有重要的指导意义。     

人IP10启动子红色荧光蛋白报告基因载体的构建及在细胞中的表达

目的:构建IP10启动子驱动的红色荧光蛋白报告基因载体,为研究细胞内IP10的基因表达调控和相关的信号转导机制提供重要工具.方法:采用基因重组技术构建含IP10启动子区的红色荧光蛋白报告基因载体pDsRed1-1-IP10;用脂质体瞬时转染HEK293 细胞,观察IP10启动子对脂多糖(LPS)刺激的反应.结果:酶切和DNA 测序证明所构建的红色荧光蛋白报告基因载体是正确的;该表达载体在HEK293细胞静息状态下表达水平很低,经LPS 刺激后,在荧光显微镜下可看到高亮度的红色荧光.结论:所构建的IP10启动子驱动的红色荧光蛋白报告基因载体是正确的,对生理相关刺激有很好的反应,可有效地用于IP10基因表达信号调控机制的研究.     

p38丝裂原激活蛋白激酶对人胚胎肾293细胞一氧化氮合酶基因转录的调控

目的探讨p38 丝裂原激活蛋白激酶(MAPK)家族四种亚型对诱导型一氧化氮合酶(iNOS)基因的转录调控。方法以人胚胎肾293(HEK 293)细胞为靶细胞,采用脂质体(LPS)介导的细胞基因共转染技术、荧光素酶报告基因技术,分别将FLAG-tagged p38 MAPK 4种亚型、含有鼠iNOS基因启动子区的荧光素酶报告基因质粒(piNOS-Luc)、空载体(pcDNA3)、β-半乳糖苷酶表达质粒(pCMV-β)共转染,检测并比较荧光素酶相对活性。结果(1)未加刺激时,在HEK 293细胞中,p38 MAPK中仅有p38α能够诱导iNOS基因启动子的转录活性;(2)在LPS刺激下,p38 MAPK 4种亚型均能够诱导iNOS启动子的转录活性,其中,p38β所诱导的转录活性最高,p38α的诱导作用亦很明显。结论(1)LPS能够在HEK 293细胞中诱导iNOS基因转录活性;(2)在HEK 293细胞中,p38 MAPK参与了静息时及LPS刺激下对iN-OS基因的转录调控。     

HPC2真核表达载体的构建及其在HEK293细胞中的表达

目的 构建在哺乳动物细胞中表达的HPC2真核表达载体，并分析其在HEK293细胞中的表达。方法 从重组pcDNA3／HPC2载体上将HPC2cDNA序列亚克隆至带有flag标记的真核表达载体pcDNA3-flag上，经PCR、酶切和测序鉴定，将重组质粒pcDNA3-flag／HPC2用脂质体瞬时转染HEK293细胞，细胞裂解后，用Western blot分析并观察HPC2在HEK293细胞中的表达情况。结果 PCR、酶切和DNA测序结果均表明重组质粒pcDNA3-flag／HPC2构建正确，并可在HEK293细胞内高效表达。结论 成功构建了pcDNA3-flag／HPC2真核表达载体，该载体能在哺乳动物细胞中有效表达，为进一步研究HPC2的功能提供了重要的实验材料。     

人eNOS启动子不同序列驱动的红色荧光蛋白载体的构建与表达

目的:为了研究人血管内皮细胞一氧化氮合酶(eNOS)启动子的功能,构建在哺乳动物细胞中表达的人eNOS启动子不同区段驱动的红色荧光蛋白报告基因载体。方法:从重组pDseNOSRed载体上将eNOS启动子的不同长度DNA序列亚克隆至红色荧光蛋白载体pDsRed1-1上,经PCR、酶切和DNA测序鉴定,将重组载体pDsF1033Red,pDsF494Red和pDsF166Red转染NIH3T3细胞,在倒置荧光显微镜下观察它们在细胞内的表达情况。结果:PCR、酶切和DNA测序结果均表明重组载体pDsF1033Red,pDsF494Red和pDsF166Red的构建正确,这些载体能在NIH3T3细胞中有效表达。由eNOS启动子不同区段驱动表达的95％以上的红色荧光蛋白均匀分布于整个细胞,转染后48-60h开始出现,96-144h为红色荧光蛋白(RFP)的表达高峰,RFP的荧光在144h最强,168h后红色荧光逐渐消退,21d后仍有很少量红色荧光残留。RFP的表达量和荧光强度明显低于强启动子p_CMVIE驱动的RFP。结论:成功构建了eNOS启动子不同区段驱动的红色荧光蛋白报告基因载体,它们能在哺乳动物细胞中有效表达,静息状态下呈现弱转录活性,为研究人eNOS启动子不同区及其顺式调控元件的作用提供了实用而又方便的工具。     

人FAT10蛋白过表达诱导饥饿状态下HEK 293细胞发生凋亡

目的:采用flag标记的人FAT10蛋白研究人FAT10蛋白对HEK293细胞的影响。方法:将FAT10基因片段克隆到载体pcDNA3-flag上,对阳性克隆进行PCR、酶切和测序鉴定,用脂质体转染HEK293细胞,用Western blotting方法检测外源性FAT10正常培养状态和饥饿状态下的HEK293细胞中的表达情况;并用XTT法和DNA ladder法观察正常培养和饥饿状态下HEK293细胞的凋亡情况。结果:重组质粒在HEK293细胞中高效表达,但在正常培养状态下和饥饿状态下表达情况不同。饥饿状态下,过表达FAT10的HEK293细胞存活率显著低于对照细胞,并且出现DNA ladder现象。结论:成功构建了带Flag标签的FAT10真核表达质粒,可在HEK293细胞中高效表达;FAT10过表达促进饥饿状态的HEK293细胞发生凋亡。     

pNTAP-PRAK真核表达载体的构建及其在HEK293细胞中的表达

目的: 构建pNTAP-PRAK真核表达质粒,并建立其稳定表达的HEK293细胞系。方法: 将人的PRAK亚克隆至串联亲和纯化(tandem affinity purification, TAP)载体pNTAP质粒上,构建成重组质粒pNTAP-PRAK,转化该重组质粒至感受态大肠杆菌DH5α,阳性克隆进行PCR、酶切及DNA测序验证正确后,利用PolyFect脂质体介导将其转染至HEK293细胞中,再通过G418筛选建立稳定表达TAP tag-PRAK融合蛋白的HEK293细胞系;利用Western blotting和细胞免疫荧光标记法检测融合蛋白TAP tag-PRAK的表达及细胞内定位情况。结果: 重组真核表达载体构建正确,该重组质粒能在HEK293细胞中稳定表达,表达产物TAP tag-PRAK主要分布在核内。结论: 成功构建pNTAP-PRAK真核表达载体并建立了其稳定表达的HEK293细胞系,TAP标签未对PRAK定位产生明显影响。     

内毒素休克小鼠肝血管靶向性结合肽的初步研究

目的研究肽CLTTWAPAC与内毒素休克BALB/c小鼠肝血管的靶向性结合作用。方法构建pET14b-SBP和pET14b-SBP-CLTTWAPAC原核表达载体,转化大肠埃希菌BL21(DE3),诱导表达纯化蛋白SBP和SBP-CLTTWAPAC。建立内毒素休克小鼠模型,将9只内毒素休克BALB/c小鼠随机均分为3组:①PBS对照组(经尾静脉先后注射灭活空噬菌体、PBS和噬菌体CLTTWAPAC,间隔5min);②SBP对照组(经尾静脉先后注射灭活空噬菌体、SBP和噬菌体CLTTWAPAC,间隔5min);③SBP-CLT-TWAPAC组(经尾静脉先后注射灭活空噬菌体、SBP-CLTTWAPAC和噬菌体CLTTWAPAC,间隔5min)。小鼠左心室灌流后取肝匀浆称重,行噬菌体计数,计算各组肝噬菌体单位重量滴度。结果 PBS对照组与SBP对照组肝噬菌体单位重量滴度差异无统计学意义(435185±57824pfu/gvs468290±74106pfu/g,P0.05),而SBP-CLTTWAPAC组肝噬菌体单位重量滴度(176059±98506pfu/g)显著降低,与两对照组比较差异均有统计学意义(P0.05)。结论 CLTTWAPAC可竞争性抑制噬菌体CLTTWAPAC与内毒素休克小鼠肝血管的结合,进一步证明CLTTWAPAC靶向性结合于内毒素休克小鼠肝血管。     

具有细胞穿透功能的串联亲和层析分离载体的构建与功能鉴定

目的建立基于抗生蛋白链菌素结合肽(SBP)-钙调蛋白结合肽(CBP)分离标签以及细胞穿透肽转录反式激活因子(TAT)和绿色荧光蛋白(GFP)原核表达系统的、具有细胞穿透功能的原核串联亲和层析分离系统。方法应用PCR方法,以pEG-FP-C2载体为模板扩增EGFP序列,以pNTAP载体为模板扩增CBP-SBP序列,采用退火方法得到TAT片段,采用常规酶切、连接方法将EGFP、CBP-SBP和TAT片段依次克隆入pET14b-MCStop载体中,酶切、PCR和测序鉴定无误后,得到pET14b-CBP-SBP-EGFP-TAT重组质粒。将重组质粒转化BL21(DE3)大肠埃希菌,以IPTG诱导融合蛋白表达,利用Ni2+-NTA亲和层析纯化获得融合蛋白,将不同浓度的融合蛋白加入培养的人肝癌细胞株(HepG2)检测融合蛋白的穿细胞膜功能。结果所构建的pET14b-MCS-CBP-SBP-EGFP-TAT融合蛋白表达载体正确,该载体可在大肠埃希菌内高效表达,用Ni2+-NTA纯化获得了相对分子量约40kD的目的融合蛋白。细胞功能实验结果表明融合蛋白能够穿越细胞膜,且具有浓度依赖性。结论成功构建了pET14b-MCS-CB...     

趋化因子CXCL16在胃癌中的表达及其临床病理学意义

目的:研究趋化因子CXCL16在胃癌和正常黏膜中的表达情况及其关系,从而探讨CXCL16在胃癌发生、发展中的作用及临床意义。方法:收集术中新鲜胃癌组织及对应的正常黏膜,进行免疫组化和RT-PCR实验检测CXCL16蛋白和mRNA水平。其表达情况与各项临床病理学指标进行对比分析,同时进行生存分析。结果:CXCL16在28例新鲜标本中,胃癌组织中CXCL16的水平明显高于癌旁正常组织。免疫组化显示CXCL16主要表达于胃癌细胞、固有腺体和浸润炎性细胞的细胞核内。通过与临床病理学指标比较显示,CXCL16的核表达与浸润深度、淋巴管浸润和UICC分期密切相关,并提示良好预后。结论:CXCL16可能参与胃癌的发生发展,其组织中的表达水平能够提示胃癌细胞的生物学行为和胃癌患者的预后。