人铜锌超氧化物歧化酶基因启动子驱动的红色荧光蛋白报告基因载体的构建及表达

目的 构建人铜锌超氧化物歧化酶基因(Cu/Zn SOD,SOD1)启动子驱动的红色荧光蛋白报告基因载体,并对其功能进行鉴定,为研究细胞内SOD1基因表达调控和相关的信号转导机制提供重要工具.方法 提取人基因组DNA,FCR扩增SOD1 5'非编码区启动子序列(-1 499- +17);采用基因重组技术构建由SOD1启动子驱动的红色荧光蛋白报告基因载体,将该载体瞬时转染Hella细胞,观察静息或佛波酯(PMA)刺激下红色荧光蛋白表达,以检测SOD1启动子的转录活性及其基凶表达.结果 酶切和DNA测序证明所构建红色荧光蛋白报告基因载体正确;该表达载体静息状态下在Hella细胞表达少量红色荧光蛋白,经PMA刺激后,能够表达较多高亮度的红色荧光蛋白.结论 成功构建了SOD1启动子驱动的红色荧光蛋白报告基因载体,其对相关刺激有很好的反应,可用于SOD1基因表达信号调控机制的研究.     

小鼠膜联蛋白A1真核表达载体的构建及其细胞内定位

目的 构建小鼠膜联蛋白A1(annexin-A1,ANXA1)真核表达载体,并检测其在NIH3T3细胞中的表达和定位.方法 采用PCR法从小鼠肝cDNA文库扩增ANXA1基因编码序列,并将其克隆至带有血凝素(HA)标记的真核表达载体pcDNA3-HA上,经PCR、酶切和测序鉴定后,将重组质粒pcDNA3-HA-ANXA1瞬时转染NIH3T3细胞,采用细胞免疫荧光法检测目的 基因表达情况.结果 菌液PCR、双酶切和DNA测序结果均表明重组质粒pcDNA3-HA-ANXA1构建正确,并可在NIH3T3细胞的胞质、胞核和胞膜中广泛表达.结论 成功构建了pcDNA3-HA-ANXA1真核表达载体,该载体中的HA-ANXA1融合基因能在哺乳动物中有效表达并正确定位,为下一步深入研究ANXAl相关的信号通路奠定了基础.     

高效液相色谱法测定安痛藤中羽扇豆醇的含量

目的建立安痛藤中羽扇豆醇含量的测定方法。方法采用高效液相色谱（HPLC）法,色谱柱为diamonsil C18（5μm,250 mm×4.6 mm）,流动相为甲醇∶水=98∶2,流速1.0 ml.min-1,检测波长206 nm,柱温为30℃。结果羽扇豆醇在0.316～3.16μg范围内与峰面积有良好线性关系,r=0.999 5,平均回收率为97.82%,RSD为2.49%。结论该方法测定安痛藤中羽扇豆醇含量快速、简便、准确、可靠。     

用FRET技术研究TLR4和MD-2的相互作用

目的 利用荧光共振能量转移（FRET）技术在活体细胞研究人Toll样受体（TLR）4与髓样细胞分化蛋白2（MD-2）的相互作用。方法 用PCR方法扩增TLR4编码序列和MD-2编码序列（不包括信号肽序列）并分别亚克隆入带TLR4信号肽的增强型青色荧光蛋白和增强型黄色荧光蛋白表达载体（pECFP-C1-SP，pEYFP-C1-SP）中，重组质粒经酶切、序列鉴定分析后分别或共同转染HEK293细胞．用荧光显微镜观察荧光蛋白表达和分布情况，并用常规的方法和受体光漂白的方法对共表达青色荧光蛋白（CFP）-TLR4和黄色荧光蛋白（YFP）-MD-2的细胞进行FRET分析。结果 重组质粒在HEK293细胞中得到表达．仅转染pECFP／TLR4或pEYFP／MD-2的细胞可见青色或黄色荧光主要分布在胞质内，以核周较多：而共转染pECFP／TLR4和pEYFP／MD-2的细胞可同时检测到青色和黄色荧光，主要分布在细胞膜，同时胞质也有少量表达。无论是用常规的方法还是受体光漂白的方法，对共表达CFP-TLR4和YFP-MD-2的细胞进行FRET分析结果表明有FRET现象的发生．提示TLR4和MD-2有相互作用并形成复合物。结论 本研究为TLR4和MD-2在活体细胞中的相互作用提供了直接的证据。     

D-二聚体对门静脉高压症术后门静脉血栓形成的早期预测价值

目的评价D-二聚体对乙肝肝硬化门静脉高压症术后门静脉血栓形成（PVT）的早期预测价值。方法用快速、半定量检测方法动态检测门静脉高压症围手术期D-二聚体浓度，同时于术前及术后7～14d内检查彩色多谱勒以观察PVT的发生情况。据不同诊断标准，计算灵敏度、特异度、阳性预测价值、阴性预测价值并进行ROC分析。结果乙肝肝硬化门静脉高压症手术后发生PVT的血栓组D-二聚体水平明显高于非血栓组（P〈0．01），ROC分析半定量D-二聚体标准及D-二聚体的定性标准对PVT均具有中等预测价值（半定量Az=0．794；P〈0．01；定性标准：Az=0．739；P〈0．01）。结论门静脉高压症术后动态检测D-二聚体水平将有助于PVT的早期诊断，如手术3d后D-二聚体水平持续升高者及手术3d后D-二聚体≥16mg／L，PVT发生的可能较大，应加强抗凝等预防和治疗。     

细胞骨架在高迁移率族蛋白B1诱导人脐静脉内皮细胞表达分泌IL-6中的作用

目的:观察体外重组高迁移率族蛋白B1(HMGB1)诱导人脐静脉内皮细胞(HUVEC)分泌释放白介素-6(IL-6)的量效关系,探讨细胞骨架在HMGB1诱导HUVEC释放IL-6中的作用.方法:构建原核表达质粒并表达纯化His-EGFP-HMGB1及His-EGFP融合蛋白,刺激体外培养的HUVEC;利用液相芯片分析系统观察HMGB1及相关细胞骨架抑制剂作用或低温培养作用下细胞分泌IL-6因子的情况.结果:酶切和DNA测序证明所构建原核表达载体正确,表达纯化的重组蛋白经SDS-PACE电泳鉴定大小正确,刺激体外培养HUVEC后IL-6高表达且具有明显量效关系;Nocodazole、Cytochalasin D等细胞骨架抑制剂作用及低温培养后可明显抑制IL-6表达.结论:体外重组的人HMGB1蛋白可以有效诱导HUVEC分泌和释放IL-6,而细胞骨架结构在此过程中起重要作用,并具有明显的能量依赖性.     

胃癌全胃切除术后并发症及死亡率影响因素的logistic分析

目的探讨经腹全胃切除术后并发症发生率及死亡率的影响因素。方法回顾性分析我院622例经腹全胃切除术胃癌患者的临床资料,按淋巴结清扫范围分为2组:D0/D1组(n=35)和D2/D3组(n=587),采用Logistic多因素回归分析研究手术后并发症发生率及死亡率的危险因素。结果全组患者术后并发症发生率和死亡率分别是9.81%(61/622)和2.89%(18/622),D0/D1组和D2/D3组的术后并发症发生率分别为8.57%(3/35)和9.88%(58/587),2组术后死亡率分别为2.86%(1/35)和2.90%(17/587),差异均无统计学意义(P0.05)。术后最常见的并发症是肠梗阻(18.03%,11/61)。logistic多元回归分析显示影响手术后并发症发生率和死亡率的危险因素是年龄≥70岁、肿瘤Ⅳ期、术前并存病、单纯手工或机械吻合、姑息性切除和联合脏器切除(P0.05),而淋巴结清除范围不是术后并发症发生率和死亡率的影响因素(P0.05)。结论晚期胃癌患者术后并发症发生率和死亡率较高,对胃癌TNMⅣ期患者行姑息性手术时应避免施行联合脏器切除术。     

小鼠HMGB1启动子红色荧光蛋白报告基因载体的构建及在真核细胞中的表达

目的 构建小鼠高迁移率族蛋白B1(HMGB1)启动子驱动的红色荧光蛋白报告基因载体,为研究细胞内HMGB1的基因表达调控和相关的信号转导机制提供重要工具.方法 采用基因重组技术构建含HMGB1启动子区的红色荧光蛋白报告基因载体pDsRed1-1-HMGB1p;脂质体法瞬时转染NIH3T3细胞.观察HMGB1启动子存正常情况下以及肿瘤坏死因子-α(TNF-α)刺激后的细胞内活性.结果 酶切鉴定和DNA测序证明所构建的红色荧光蛋白报告基凼载体正确:该载体在NIH3T3细胞内静息状态呈低水平表达,经TNF-α刺激后,观察到表达高亮度红色荧光的细胞明显增多.结论所构建的HMGB1启动子红色荧光蛋白报告基因载体正确,具有正常启动蛋白表达的活性,可有效用于HMGB1基因表达信号调控机制的研究.     

乌司他丁治疗急性胰腺炎的系统评价

目的评价乌司他丁治疗急性胰腺炎的有效性与安全性。方法利用RewMan4.2软件,对乌司他丁治疗急性胰腺炎的随机对照试验(RCT)进行Meta分析。结果共纳入16篇RCT,Meta分析结果显示,乌司他丁组的治疗有效率明显高于常规组(P0.00001);乌司他丁组的血淀粉酶恢复正常时间、腹痛及腹部压痛消失时间、平均住院时间明显短于常规组(P0.00001);乌司他丁治疗重症急性胰腺炎的并发症发生率明显降低(P=0.006);6个试验记录乌司他丁治疗后未发现有不良反应,2个试验记录有1例病人出现不良反应;没有试验记录乌司他丁治疗后有病死情况。结论乌司他丁在改善急性胰腺炎近期临床疗效指标方面优于常规治疗,但远期疗效尚待研究评价。     

人p53不同突变体的构建、表达及其对亚砷酸盐诱导细胞凋亡的影响

目的 构建人p53的不同突变体,并在真核细胞中表达,研究这些突变体对应激刺激诱导细胞凋亡的影响.方法 采用PCR方法扩增人p53 cDNA序列,使用常规酶切、连接方法将其重组至pcDNA3/HA载体中,对阳性克隆进行酶切和PCR鉴定.将阳性重组体的第15位和第46位丝氨酸突变为丙氨酸,并转染NIH3T3细胞,观察其在NIH3T3细胞内的表达情况.转染不同突变体的NIH3T3细胞用Annexin V-FITC和碘化丙啶双标后,利用流式细胞术检测亚砷酸盐刺激前后的凋亡情况.结果 构建的pcDNA3/HA-p53(WT)、pcDNA3/HA-p53(S15A)peDNA3/I-IA-p53(S46A)是正确的,且能在NIH3T3细胞内有效表达.流式细胞术检测表明,p53(WT)的表达使亚砷酸盐诱导的细胞凋亡增加,p53(S15A)的表达使细胞凋亡减少.而p53(S46A)没有明显影响.结论 p53的第15位丝氨酸在其介导亚砷酸盐诱导的细胞凋亡中具有重要作用.