VEGF-D及其受体VEGFR-3在非小细胞肺癌中的表达与淋巴结转移的关系

  目的   对VEGF-D及其受体VEGFR-3在良性疾病肺组织和非小细胞肺癌（NSCLC）组织中的表达进行研究,探寻其相互之间的关系,从而进一步探讨VEGF-D、VEGFR-3在肺癌发生及NSCLC淋巴管生成和淋巴结早期转移中的作用。   方法   收集非小细胞肺癌患者术后肺组织标本52例,良性疾病肺组织30例,应用半定量逆转录聚合酶链反应法（RT-PCR）检测良性疾病肺组织及肺癌组织中VEGF-D、VEGFR-3 mRNA的表达量。   结果   VEGF-D mRNA、VEGFR-3 mRNA在肺癌组织中的表达水平较良性疾病肺组织表达水平明显升高（P < 0.05）。VEGF-D、VEGFR-3 mRNA在肺癌组织中的表达与淋巴结转移无显著相关。   结论   VEGF-D、VEGFR-3 mRNA的表达与肺癌发生有显著的相关性。      

结核分枝杆菌mpt51基因原核表达载体的构建、表达和纯化

目的 构建结核分枝杆菌mpt51基因原核表达载体并进行表达、纯化.方法 用PCR扩增结核分枝杆菌mpt51基因,并克隆入pTA2质粒.测序正确后.再亚克隆人pET30a(+)质粒,构建pET30a(+):mpt51重组体.结果 以pET30a(+):mpt51转化BL21(DE3)后.经0.4 mmol/L异丙基硫代-β-D-半乳糖苷诱导,重组菌表达出相对分子质量为38 000的重组蛋白.SDS-PAGE分析显示,异丙基硫代-β-D-半乳糖苷诱导4小时重组蛋白的表达量最高.表达蛋白以包涵体形式存在于胞质中.表达量占全菌蛋白质的30%.经Ni-NTA树脂纯化,获得纯度为90%的重组蛋白.结论 成功地构建原核表达载体pET30a(+):mpt51,并获得MPT51重组蛋白.为血清学诊断活动性结核病奠定了基础.     

结核分枝杆菌glcB基因原核表达载体的构建、表达和纯化

目的构建结核分枝杆glcB基因原核表达载体,并进行表达,纯化。方法用PcR扩增结核分枝杆菌glcB基因,并克隆入pTA2质粒。测序正确后,再亚克隆入pET30a（＋）质粒,构建pET30a（＋）：glcB重组体。结果以重组体转化BL21（DE3）后,经0．4mM异丙基硫代-β．D．半乳糖苷（IPTG）诱导,表达出分子量为92KD重组蛋白。SDS—PAGE分析显示,IPTG诱导4h重组蛋白的表达量最高。表达蛋白以包涵体形式存在于胞质中,表达量占全菌蛋白质的50％。经Ni-NTA柱纯化,获得纯度为90％的重组蛋白。结论成功地构建原核表达载体pET30a（＋）：glcB,并获得GIcB重组蛋白,为血清学诊断活动性结核病奠定了基础。     

酶联免疫斑点检测斑点形成细胞在结核潜伏感染诊断中的价值

目的探讨酶联免疫斑点检测（ELISPOT）斑点形成细胞（SFC）在结核潜伏感染中的诊断价值。方法结核组132例,健康对照组44名,有结核暴露史的健康组55名,应用克隆表达的早期分泌抗原靶6KD／培养滤液蛋白10KD融合蛋白（ESAT-6／CFP-10融合蛋白）、早期分泌抗原靶6KD（ESAT-6）进行酶联免疫斑点实验,检测观察对象的斑点形成细胞（SFC）的数量,并对有结核暴露史者进行结核菌素试验（TST）。结果ESAT-6／CFP-10融合蛋白-ELISPO．r、ESAT-6-ELISPOT在结核组形成SFC数量（M分别为147．5和27．5）显著高于在有结核暴露史健康组形成的SFC数量（M分别为30和10,P分别为O000和O．003）;有结核暴露史健康组形成的SFC数量（M分别为30和lO）显著高于健康对照形成SFC的数量（M分别为10和5,均P〈005）。ESAT-6／CFP-10-ELISPOT与ESAT-6．ELISPOT比较,其与结核暴露史具有更明显的相关性（X2=6．942,P=0．008）,而两种ELISPOT检测均与BCG接种无关;TST则主要受BCG接种的影响（x2=8．967,P=0．003）。结论ESAT-6／CFP-10融合蛋白-ELISPOT与TST比较,ESAT-6／CFP-10融合蛋白-ELISPOT有可能根据SFC的数量来鉴别结核潜伏感染和活动性结核病成为诊断结核潜伏感染的更加准确的方法。     

结核分枝杆菌休眠菌的复苏培养与初始菌量的关系

目的探讨复苏因子对结核分枝杆菌休眠菌复苏作用与初始菌量的关系。方法取培养100d的陈旧结核分枝杆菌（休眠菌）,用7H9稀释成麦氏比浊1mg／ml,之后倍比稀释成0．5、0．25、0．125、0．0625、0．03125mg／ml。取12支无菌培养管,加入5ml7H9培养基并分为2组,每组依次加入上述各浓度结核分枝杆菌,第1组加入复苏因子蛋白质,第2组作为对照加入等体积7H9,37℃培养,分别在15、25、30、35d检测光密度值,并取1μ1培养液涂7H11平板培养,进行菌落计数。重复上述实验。结果0、15、25、30、35d分光光度计检测光密度（OD）值结果显示：各浓度组间细菌增殖呈直线正相关性（P〈0,05,P〈0．01）,即复苏因子对不同稀释浓度的复苏作用相同。7H11培养结果和OD值检测结果显示：各组两种方法检测结果呈直线相关性（P〈0．05,P〈001）,即两种方法检测结果有一致性。结论复苏因子对结核分枝杆菌休眠菌的复苏作用与初始菌量无关。     

SYBR GreenⅠ荧光PCR熔解曲线鉴定鸟分枝杆菌方法的建立及初步应用

目的基于SYBR GreenⅠ荧光染料建立鉴定鸟分枝杆菌(Mycobacterium avium,MA)的荧光PCR熔解曲线法,为临床鉴定MA提供简单、准确性高的分子生物学检测方法。方法以MA的特异性插入序列IS1311为检测靶标设计引物,在60℃的退火温度下,建立鉴定MA的SYBR GreenⅠ荧光PCR熔解曲线方法,并对MA等21种分枝杆菌标准株和金黄色葡萄球菌等5种常见致病菌进行检测,评价方法的特异性、检测限;以hsp65、16S rDNA普通PCR扩增产物测序分析为“金标准”,鉴定200株分枝杆菌临床分离株,评估建立方法鉴定MA的准确性。结果SYBR GreenⅠ荧光PCR熔解曲线方法在30个循环内能准确鉴定出21种分枝杆菌标准株和5种致病菌中的MA,检测限为5.6×10-2 ng/μL。200株分枝杆菌临床分离株中,以PCR测序鉴定出16株MA和184株其他分枝杆菌,以SYBR GreenⅠ荧光PCR熔解曲线方法鉴定出15株MA和185株非MA;本研究建立的方法和测序方法对MA的鉴定率差异无统计学意义(P>0.05);两法符合率为99.5%(199/200),一致性较高(Kappa值>0.75,P<0.01);建立方法的敏感性为93.8%(15/16),特异性为100.0%(184/184),阳性预测值为100.0%(15/15),阴性预测值为99.5%(184/185)。结论以MA特异性重复序列IS1311为基础建立的SYBR GreenⅠ荧光PCR熔解曲线方法,具有较高的灵敏度和特异性,为MA的临床检测提供新的途径。     

结核分枝杆菌rv3873基因原核表达载体的构建、表达和纯化

目的构建结核分枝杆菌（M.tb）rv3873基因原核表达载体并进行表达。方法用PCR扩增MTB rv3873基因，并克隆入pGEM-T Easy质粒。测序正确后，再亚克隆入pET30a（＋）质粒，构建pET30a（＋）：rv3873重组体。结果以重组体分别转化DH5α和BL21（DE3）菌后，经0．4mM异丙基硫代-β-D-半乳糖苷（IPTG）诱导，pET30a（＋）：rv3873表达出分子量为47000左右的重组蛋白。SDS-PAGE分析显示，IPTG诱导4h重组蛋白的表达量最高。表达蛋白以包涵体形式存在于胞质中，表达量占全菌蛋白质的50％，Western blot证实其具有良好的抗原性。经Ni—NTA柱纯化，获得纯度为90％的重组蛋白。结论成功地构建原核表达载体pET30a（＋）：rv3873，并获得PPE68重组蛋白，为辅助诊断结核菌的感染奠定了基础。     

噻唑蓝和刃天青法在一线抗结核药物药敏试验中的应用

目的评价噻唑蓝（3．（4,5-二甲基噻唑）-2,5-二苯基溴化四氮唑蓝,MTT]和刃天青（resazurin）2种快速而价廉的药敏试验方法进行一线抗结核药物的药敏试验的可行性。方法分别用MTT和刃天青2种微孔板方法对64株结核临床分离菌株进行一线抗结核药物的药敏检测,并将结果与传统罗氏培养基的绝对浓度法的结果进行比较分析。结果MTT和刃天青2种微孔板方法所得利福平（RFP）、异烟肼（INH）、乙胺丁醇（EMB）、链霉素（SM）4种一线抗结核药物的药敏结果与传统绝对浓度法有较好的一致性,MTT法进行RFP、INH、EMB、SM药敏试验的敏感性分别为94．8％、93．8％、92．9％、90．6％,特异性分别为96．0％、93．8％、96．0％、87．5％,准确性分别为95．3％、93．8％、95．3％、89．1％;刃天青法进行RFP、INH、EMB、SM药敏试验的敏感性分别为92．3％、90．6％、92．9％、87．5％,特异性分别为96．O％、90．6％,94．0％、87．5％,准确性分别为93．8％、90．6％、93．8％、87．5％。4种一线抗结核药物应用MTT法与绝对浓度法的Kappa值为：RFP0．857,INH0．831,EMB0．714,SM0．792;应用刃天青法与绝对浓度法的Kappa值为：RFP0．871,INH0．826,EMB0．826,SM0．750。MTT和刃天青2种药敏方法4种一线抗结核药物的Kappa值为：RFP0．889,INH0．875,EMB0．787,SMO．844。结论MTT和刃天青是2种简单快速、价廉且敏感的药敏方法,有希望成为一线抗结核药物药敏试验的候选方法。     

肺癌患者血清氧化/抗氧化状态的初步研究

目的 通过对141例原发性肺癌患者血清中抗氧化酶和氧化代谢产物的测定,观察肺癌患者氧化/抗氧化状态的特点,为补充或完善肺癌发生和发展机制提供依据.方法 用比色法测定患者的氧化/抗氧化酶的活性、含量,包括总抗氧化能力、总超氧化物歧化酶(包括锰超氧化物歧化酶和铜锌超氧化物歧化酶)、谷胱甘肽过氧化物酶、过氧化氢、丙二醛.结果 与正常组相比,肺癌患者血清中总抗氧化能力、锰超氧化物歧化酶和谷胱甘肽过氧化物酶明显降低(P＜0.01),铜锌超氧化物歧化酶、过氧化氢、丙二醛明显增高(P＜0.01).肺腺癌、小细胞癌组血清过氧化氢高于肺鳞状细胞癌组(P＜0.05);不同分化程度组间差异无统计学意义;Ⅳ期总超氧化物歧化酶较Ⅰ期患者增高(P＜0.01).结论 肺癌患者存在氧化/抗氧化失衡,其特点为血清中除铜锌超氧化物歧化酶外,抗氧化酶活性降低,氧化代谢产物增高.不同组织学类型及TNM分期对肺癌患者氧化/抗氧化失衡有一定的作用.     

VEGF—C及VEGFR-3在非小细胞肺癌中的临床意义

目的研究VEGF-C和VEGFR-3的表达在非小细胞肺癌中的临床意义。方法对78例病理分期为Ⅰ～Ⅲ。期非小细胞肺癌患者术后组织标本中癌组织、癌旁组织及正常组织共计234份进行半定量PCR研究。同时对VEGF-C和VEGFR-3mRNA的表达与其不同的病理类型、分期、分化程度及其他临床特性进行分析。结果VEGF—C mRNA的表达水平在癌组织及癌旁组织的相对含量明显高于正常组织（P〈0．05）,VEGFR-3mRNA的表达在癌组织中的相对含量明显高于正常组织（P〈0．05）。VEGF-C和VEGFR-3mRNA的表达与临床病理特性相互之间的关系显示,在淋巴结转移组及病理分期组,VEGF-C或VEGFR-3mRNA的表达水平无论是在癌组织中,还是在癌旁组织中均有明显统计学意义（P〈0．001）。结论VEGF-C和VEGFR-3mRNA的表达与非小细胞肺癌的淋巴结转移有关,提示VEGF—C和VEGFR-3mRNA的表达的非小细胞肺癌预后不良：