结核分枝杆菌感染的免疫学检测技术研究进展及临床应用现状

结核病仍然是全球和我国重点防控的传染病之一。尽管目前已将结核分枝杆菌核酸检测阳性纳入结核病确诊依据之一,但临床仍然存在大量病原学阴性的结核病患者,需要依靠免疫学检测技术进行辅助诊断。结核分枝杆菌入侵宿主后引发的免疫病理反应及抗结核免疫应答反应是开发免疫学检测技术的基础,参与免疫应答不同阶段的各类细胞、细胞因子、趋化因子、抗体等都是潜在的免疫学诊断靶标。近年来,基于这些靶标开发了多项免疫学检测新技术,包括γ-干扰素释放试验、新型结核菌素皮肤试验、干扰素诱导蛋白-10(IP-10)检测、γ-干扰素/白细胞介素-2(IFN-γ/IL-2)双因子检测等,为结核分枝杆菌感染和结核病的诊断带来了新的希望。此外,尚有一些处在研发过程的新型蛋白标识物、多功能淋巴细胞等也表现出较好的潜在诊断价值。笔者将对已用于临床的免疫学诊断技术的应用现状及优缺点进行综述,并探讨未来可能进入临床应用的标识物和其他潜在靶标。     

脑脊液标志物在结核性脑膜炎诊断中的研究进展

结核性脑膜炎(tuberculous meningitis, TBM)患者早期的临床表现和影像学变化均不具有特异性,且缺乏有效的实验室诊断方法,致使其诊断异常困难。早期诊断TBM对于患者的及时治疗和改善预后至关重要。脑脊液(cerebrospinal fluid, CSF)中存在多种生物标志物,对TBM早期诊断具有一定的潜在价值。本文主要针对CSF中宿主诊断生物标志物用于TBM诊断的研究进展及挑战进行综述和讨论。     

多位点可变数量串联重复序列分析在北京家族结核分枝杆菌基因分型中的应用及位点筛选

目的对于北京家族菌株占绝大多数的感染人群,评价多位点可变数量串联重复序列（variable number tandem repeats,VNTR）分析（multiple loci VNTR analysis,MLVA）中不同位点组合在结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis,MTB）基因分型研究中的应用。并以IS6110限制性片段长度多态性（restriction fragment length polymorphism,RFLP）为参照,筛选有效位点。方法分别采用IS6110-RFLP、间隔区寡核苷酸分型（Spoligotyping）及MLVA不同位点组合对北京海淀区收集的MTB临床分离株进行基因分型研究,比较3种方法及MLVA不同位点组合的分型效果。结果 45株MTB分离株中86.7%为北京家族菌株,Spoligotyping和结核分枝杆菌散在分布重复单位（mycobacterial interpersed repetitive units,MIRU）-12系列的HGI（Hunter-Gaston Index）值分别为0.4313和0.8700,将45株MTB菌株分为10个和23个基因型。VNTR-9系列和IS6110-RFLP的分型结果一致,HGI值较高,为0.9980,将45株MTB菌株分为43个基因型。结论北京家族结核分枝杆菌在北京海淀区呈高水平流行。对于北京地区北京家族菌株占绝大多数的感染人群,VNTR-9系列MLVA是较为简便和高分辨率的分型方法 ,其分辨率能够达到MTB基因分型＂金标准＂IS6110-RFLP水平。     

肺癌组织中抗氧化酶及氧化代谢物变化的定量分析

背景与目的抗氧化酶与肿瘤的关系逐渐受到重视。通过对113例原发性肺癌患者手术切除肿瘤组织和肿瘤远端正常肺组织的抗氧化酶和氧化代谢物及SODmRNA及其蛋白表达量的测定,观察肺癌组织氧化／抗氧化状态的特点,为补充或完善肺癌发生和发展机制提供一定的依据。方法用比色法测定肺癌组织抗氧化酶活性和氧化代谢物含量,包括：总超氧化物歧化酶（TSOD）（包括MnSOD和CuZnSOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（GPx）、过氧化氢（H2O2）、丙二醛（MDA）,用半定量PCR和Westernblot法测定患者组织中MnSOD和CuZnSOD的mRNA和蛋白表达量。结果①与肿瘤远端正常肺组织相比,肺癌组织中的TSOD、CuZnSOD、GPx活性增高,H2O2、MDA降低（P〈0．05或0．01）。②肺腺癌组织中的氧化代谢物H2O2、MDA高于肺鳞癌组织（P〈0．05或0．01）。③与肿瘤远端正常肺组织相比,肺癌组织中MnSODmRNA和蛋白表达量降低,CuZnSODmRNA和蛋白表达量增高（P〈0．01）。结论肺癌组织存在着氧化／抗氧化失衡。SOD的异常表达水平均出现细胞异常生长,提示氧化／抗氧化失衡与肺癌的发生和发展存在一定的关系。     

冷球蛋白血症相关性肾病1例

<正>1 临床资料患者,女,62岁,因“双下肢水肿1个月”入院。患者缘于1个月前无明显诱因出现双下肢水肿,就诊于当地医院,辅助检查提示尿蛋白4+,予以保肾、补充白蛋白及对症治疗后未见明显好转,患者及家属为求进一步诊治就诊。病程中1周前有发热,体温最高达37.8℃,给予物理降温后体温降至正常,后未再发热。既往有高血压史1个月,血压最高达199/104 mmHg, 口服替米沙坦 40 mg每日1次及吲达帕胺 2.5 mg每日1次口服,     

结核分枝杆菌rv3873基因原核表达载体的构建、表达和纯化

目的构建结核分枝杆菌（M．tb）rv3873基因原核表达载体并进行表达。方法用聚合酶链反应（PCR）扩增MTBrv3873基因,并克隆入pGEM～TEasy质粒。测序正确后,再亚克隆入pET30a（＋）质粒,构建pET30a（＋）：rv3873重组体。结果以重组体分别转化DH5a和BL21（DE3）菌后,经0．4mmol／L异丙基硫代-β-D-半乳糖苷（IPTG）诱导,pET30a（＋）：rv3873表达出相对分子质量为47000左右的重组蛋白。SDS-PAGE分析显示,IPTG诱导4h重组蛋白的表达量最高。表达蛋白以包涵体形式存在于胞质中,表达量占全菌蛋白质的50％,Westernblot证实其具有良好的抗原性。经Ni-NTA柱纯化,获得纯度为90％的重组蛋白。结论成功地构建原核表达载体pET30a（＋）：rv3873,并获得重组Rv3873蛋白,为辅助诊断结核菌的感染奠定了基础。     

结核分枝杆菌Rv2352c基因的克隆表达及其抗原活性鉴定

目的构建含结核分枝杆菌(M.tb)rv2352c基因原核表达载体,经转化E.coli以表达Rv2352c融合蛋白,并研究其抗原性。方法用PCR扩增M.tb rv2352c基因,克隆入pET30a(+)质粒,构建pET30a(+):rv2352c重组质粒,阳性克隆测序验证正确后转化入表达宿主大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导Rv2352c蛋白表达。经Ni+-NTA层析柱纯化融合蛋白,通过SDS-PAGE和结核患者血清Western blot进行鉴定。将纯化的重组蛋白分别免疫家兔,制备抗Rv2352c抗血清,抗血清的效价测定采用酶联免疫吸附试验法(ELISA),取兔抗血清与纯化蛋白Rv2352c通过Western blot方法,检测抗体特异性。结果经酶切鉴定和测序分析证实rv2352c原核表达质粒构建正确,SDS-PAGE和Western blot结果显示,在45 kD处呈现单一蛋白条带。用重组蛋白Rv2352c免疫接种后可诱导出高滴度的特异性抗体。纯化蛋白通过Western blot鉴定证实为目的蛋白,有较强的免疫原性。结论成功构建原核表达重组质粒pET30a(+):rv2352c,制备和纯化的Rv2352c融合蛋白具有较好的纯度和生物学功能,为进一步研究结核病的潜在分子标志物奠定基础。     

两种γ-干扰素释放试验在结核性胸膜炎中的辅助诊断价值

目的 评价基于外周血单个核细胞的酶联免疫斑点试验(T-SPOT.TB)和基于全血的酶联免疫吸附试验(QuantiFERON-TB Gold in-tube,QFT-GIT)在结核性胸膜炎中的辅助诊断价值.方法 收集2016年12月至2017年12月在首都医科大学附属北京胸科医院住院确诊的胸腔积液患者60例(除临床诊断和未确诊病例122例),其中结核性胸膜炎37例(结核组),非结核性胸膜炎23例(对照组),同时行胸腔积液和外周血T-SPOT.TB和QFT-GIT检测.结果 胸腔积液和外周血中,结核组T-SPOT.TB斑点形成细胞(spot forming cell,SFC)数与QFT-GIT检测的IFN-γ释放量值均明显高于对照组,差异均有统计学意义(P＜0.01);结核组中胸腔积液T-SPOT.TB检测的SFC数显著高于外周血SFC数,差异有统计学意义(P＜ 0.01).胸腔积液T-SPOT.TB检测的ROC曲线下面积(AUC)为0.932,高于外周血QFT-GIT检测(0.874)、外周血T-SPOT.TB检测(0.855)和胸腔积液QFT-GIT检测(0.779).胸腔积液T-SPOT.TB检测中不确定结果比例(16.7％)显著低于QFT-GIT (46.7％),差异均有统计学意义(P＜0.01).结论 T-SPOT.TB检测方法更适用于胸腔积液的检测,可辅助结核性胸膜炎的早期诊断.     

结核分枝杆菌休眠菌的复苏培养与初始菌量的关系

目的 探讨复苏因子对结核分枝杆菌休眠菌复苏作用与初始菌量的关系.方法 取培养100 d的陈旧结核分枝杆菌(休眠菌),用7H9稀释成麦氏比浊1 mg/ml,之后倍比稀释成0.5、0.25、0.125、0.0625、0.03125 mg/ml.取12支无菌培养管,加入5 ml 7H9培养基并分为2组,每组依次加入上述各浓度结核分枝杆菌,第1组加入复苏因子蛋白质,第2组作为对照加入等体积7H9,37℃培养,分别在15、25、30、35 d检测光密度值,并取1μl培养液涂7H11平板培养,进行菌落计数.重复上述实验.结果 0、15、25、30、35 d分光光度计检测光密度(OD)值结果显示:各浓度组间细菌增殖呈直线正相关性(P<0.05,P<0.01),即复苏因子对不同稀释浓度的复苏作用相同.7H11培养结果和OD值检测结果显示:各组两种方法检测结果呈直线相关性(P<0.05,P<0.01),即两种方法检测结果有一致性.结论 复苏因子对结核分枝杆菌休眠菌的复苏作用与初始菌量无关.     

VEGF—C及VEGFR-3在非小细胞肺癌中的临床意义

目的研究VEGF-C和VEGFR-3的表达在非小细胞肺癌中的临床意义。方法对78例病理分期为Ⅰ～Ⅲ。期非小细胞肺癌患者术后组织标本中癌组织、癌旁组织及正常组织共计234份进行半定量PCR研究。同时对VEGF-C和VEGFR-3mRNA的表达与其不同的病理类型、分期、分化程度及其他临床特性进行分析。结果VEGF—C mRNA的表达水平在癌组织及癌旁组织的相对含量明显高于正常组织（P〈0．05）,VEGFR-3mRNA的表达在癌组织中的相对含量明显高于正常组织（P〈0．05）。VEGF-C和VEGFR-3mRNA的表达与临床病理特性相互之间的关系显示,在淋巴结转移组及病理分期组,VEGF-C或VEGFR-3mRNA的表达水平无论是在癌组织中,还是在癌旁组织中均有明显统计学意义（P〈0．001）。结论VEGF-C和VEGFR-3mRNA的表达与非小细胞肺癌的淋巴结转移有关,提示VEGF—C和VEGFR-3mRNA的表达的非小细胞肺癌预后不良：