VEGF-C及VEGFR-3在非小细胞肺癌中的临床意义

目的研究VEGF-C和VEGFR-3的表达在非小细胞肺癌中的临床意义。方法对78例病理分期为Ⅰ~ⅢA期非小细胞肺癌患者术后组织标本中癌组织、癌旁组织及正常组织共计234份进行半定量PCR研究。同时对VEGF-C和VEGFR-3mRNA的表达与其不同的病理类型、分期、分化程度及其他临床特性进行分析。结果VEGF-C mRNA的表达水平在癌组织及癌旁组织的相对含量明显高于正常组织(P<0.05),VEGFR-3mRNA的表达在癌组织中的相对含量明显高于正常组织(P<0.05)。VEGF-C和VEGFR-3mRNA的表达与临床病理特性相互之间的关系显示,在淋巴结转移组及病理分期组,VEGF-C或VEGFR-3mRNA的表达水平无论是在癌组织中,还是在癌旁组织中均有明显统计学意义(P<0.001)。结论VEGF-C和VEGFR-3mRNA的表达与非小细胞肺癌的淋巴结转移有关,提示VEGF-C和VEGFR-3mRNA的表达的非小细胞肺癌预后不良。     

噻唑蓝和刃天青法在一线抗结核药物药敏试验中的应用

目的 评价噻唑蓝[3-(4,5-二甲基噻唑)-2,5-二苯基溴化四氮唑蓝,MTT]和刃天青(resazurin)2种快速而价廉的药敏试验方法进行一线抗结核药物的药敏试验的可行性.方法 分别用MTT和刃天青2种微孔板方法对64株结核临床分离菌株进行一线抗结核药物的药敏检测,并将结果与传统罗氏培养基的绝对浓度法的结果进行比较分析.结果 MTT和刃天青2种微孔板方法所得利福平(RFP)、异烟肼(INH)、乙胺丁醇(EMB)、链霉素(SM)4种一线抗结核药物的药敏结果与传统绝对浓度法有较好的一致性,MTT法进行RFP、INH、EMB、SM药敏试验的敏感度分别为94.8%、93.8%、92.9%、90.6%,特异度分别为96.0%、93.8%、96.0%、87.5%,准确性分别为95.3%、93.8%、95.3%、89.1%;刃天青法进行BFP、INH、EMB、SM药敏试验的敏感度分别为92.3%、90.6%、92.9%、87.5%,特异度分别为96.0%、90.6%、94.0%、87.5%,准确性分别为93.8%、90.6%、93.8%、87.5%.4种一线抗结核药物应用MTT法与绝对浓度法的Kappa值为:RFP 0.857,INH 0.831,EMB 0.714,SM 0.792;应用刃天青法与绝对浓度法的Kappa值为:RFP 0.871,INH 0.826,EMB 0.826,SM 0.750.MTT和刃天青2种药敏方法4种一线抗结核药物的Kappa值为:RFP 0.889,INH 0.875,EMB 0.787,SM 0.844.结论 MTT和刃天青是2种简单快速、价廉且敏感的药敏方法,有希望成为一线抗结核药物药敏试验的候选方法.     

细胞色素P450基因多态性与肺癌易感性的相关性分析

目的 探讨代谢活化酶细胞色素P4501A1（CYP1A1）、2D6（CYP2D6）、2E1（CYP2E1）和代谢解毒酶谷胱甘肽硫转移酶（GSTM1）与肺癌易感性的关系。方法采用PCR、PCR—RFLP技术检测原发性肺癌组（279例）及对照组（684例）的CYPlAI、CYP2D6、CYP2E1、GSTM1代谢酶基因型，对不同基因型在两组分布频率的差异进行OR值的统计分析。结果CYPlAl突变等位基因（m）、GSTMl功能缺失型（-）分别可使患肺癌的危险性增加1．64（OR=1．64，95％CI为1．21—2．22，P=0．001）和1．58倍（oR=1．58，95％CI为1，19—2．11，P=0．002）。其中CYPlAl与肺鳞癌、小细胞癌，GSTMl与肺鳞癌及肺腺癌明显相关（均P〈0．05）。同时携带GSTMI（-）和CYPlAl（m）可使患肺癌的危险性明显增加（OR=2．75，95％CI为1．73～4．39，P=O．OOO）。在重度吸烟人群携带GSTMl（-）、CYPlAl（m）、CYP2D6（W）或CYP2ElA基因型均可使患肺癌的危险性显著增加5．71—11．67倍（辟O．000）。结论携带GSTMI（-）及CYPlAl（m）等位基因型者患肺癌的危险性上升，二者有协同作用。在重度吸烟人群，CYP及GSTMl的检测有利于发现肺癌的高危人群。     

检测血清抗脂阿拉伯甘露糖IgG抗体（LAM—IgG）对结核病的诊断价值

目的 评价ＲａｐｉｄｆｌＴＭ试剂盒检测血清抗脂阿拉甘露酯ＩｇＧ抗体对结核病的诊断价值。方法 采用快速斑点免疫金渗滤法检测活动性肺结核６０例，骨结核６例，胸膜炎３例，脑膜炎２例，肺癌３０例及３０例健康人血清中ＬＡＭ－ＩｇＧ。结果 活动性结核病组ＬＡＭ－ＩｇＧ阳性率６９％，肺癌及正常对照组ＬＡＭ－ＩｇＧ假阳性率５％，结论血清ＬＡＭ－ＩｇＧ测定对活动性结核病有较好的辅助诊断价值。     

结核分枝杆菌复苏因子E的真核表达及鉴定

目的 构建结核分枝杆菌复苏因子E基因的真核表达质粒.方法 PCR扩增结核分枝杆菌复苏因子E基因片段.将片段克隆至PcDNA 3.1(一)载体,重组质粒测序正确后,转染至CHO细胞中,表达复苏因子E蛋白质.RT-PCR检测克隆基因mRNA在真核细胞中的表达,收集并纯化表达的蛋白质,SDS-PAGE分析和Western blot分析检测目的 蛋白的表达,淋巴细胞增殖实验(CCK-8)鉴定表达蛋白的免疫原性.结果 成功构建了结核分枝杆菌复苏因子E基因的真核表达质粒.RT-PCR证实克隆基因mRNA在真核细胞中表达,SDS-PAGE分析和Western blot分析均证实目的 蛋白在真核细胞中成功表达,淋巴细胞增殖实验(CCK-8)进一步证实了表达蛋白具有免疫原性.结论 我们成功构建了复苏因子E真核表达系统.     

结核分枝杆菌特异性分泌蛋白的原核表达、纯化和免疫原性分析

目的构建结核分枝杆菌rv1837c．rv3803c基因原核表达重组质粒,进行表达、纯化,并分析其免疫原性。方法PCR扩增结核分枝杆菌H37Rvrv1837c．rv3803c基因,并克隆入pTA2质粒。测序正确后,再亚克隆入pET30a（＋）质粒,构建pET30a（＋）：rv1837c．pET30a（＋）：rv3803c重组体。然后转化人表达宿主大肠杆菌BL21（DE3）,经0．4mmol／L异丙基硫代-β—D-半乳糖苷诱导1分别与组氨酸标签单克隆抗体及结核患者血清进行Western—blot,鉴定Rv1837c、Rv3803c重组蛋白。经镍离子螯和氮川乙酸一组氨酸标签亲和树脂纯化,将纯化的重组蛋白分别免疫家免,取兔血清与纯化蛋白通过Western-blot方法,检测家兔血清中的抗体。结果pET30a（＋）：rv1837c．pET30a（＋）：rv3803c重组体表达相对分子质量为92000及38000的重组蛋白,表达蛋白以包涵体形式存在于胞质中,表达量分别占全菌蛋白质的30％及50％。获得纯度为90％的重组蛋白。纯化蛋白通过Western-blot鉴定证实为目的蛋白,有较强的免疫原性。结论成功构建原核表达重组质粒pET30a（＋）：rv1837c,pET30a（＋）：rv3803c,并获得Rv1837c及Rv3803c重组蛋白,为血清学诊断活动性结核病奠定了基础。     

结核分枝杆菌复苏因子对结核性胸腔积液中结核分枝杆菌生长促进作用的探索

目的探讨结核分枝杆菌复苏因子（resuscitationpromotingfactor,Rpf）对结核性胸腔积液中病原菌生长的促进作用,以期提高临床标本体外培养阳性率,缩短培养时间。方法选择2012年10月至2013年10月期间北京胸科医院62例结核性胸膜炎患者,抽取胸腔积液经过离心处理后分别接种于改良罗氏培养基,以及含高、低浓度Rpf的MiddleBrook7H11固体培养基（简称“7H11培养基”）和生理盐水7H11培养基（生理盐水阴性对照组）中,每隔3d观察菌落形成情况,阳性者行抗酸染色（AFB）、PCR扩增试验及DNA测序进行菌种鉴定,观察比较高、低浓度Rpf对Mtb的促进生长作用。利用统计软件SPSS17．0进行统计学分析。Rpf培养组与改良罗氏培养组,以及Rpf培养组与生理盐水阴性对照组Mtb培养阳性率比较采用配对计数资料的x2检验;不同浓度Rpf培养组与生理盐水阴性对照组可视菌落平均时间（d）和阳性菌落数量比较采用配对样本t检验。以P〈0．05为差异有统计学意义。结果（1）结核性胸腔积液改良罗氏培养组中的Mtb培养阳性率为16．1％（10／62）,含Rpf的7H11培养基中的Mtb培养阳性率为43．5％（27／62）,两者比较差异具有统计学意义（x2=12．84,P〈0．01）;（2）含高、低浓度Rpf7H11培养基的可视菌落形成时间各为（20．92±0．58）d和（21．69±0．50）d,两组间差异无统计学意义（t=0．085,P〉0．05）,但显著快于生理盐水对照组（不含Rpf）的（38．08±0．94）d（t值分别为10．19、9．91,P值均GO．001）;（3）含高、低浓度Rpf的7H11培养基菌落形成单位数各为（34．12±4．06）×10^2和（37．27±5．63）×10^2,两组间差异无统计学意义（t=0．45,P〉0．05）,但显著多于生理盐水对照组（3．77±0．88）×10^2（t值分别为5．88、7．30,P值均〈0．001）。结论接种结核性胸腔积液后,含Rpf的7H11培养基较改良罗氏培养基可提高Mtb的培养阳性率,并缩短培养时间。     

耻垢分枝杆菌新型毒素-抗毒素系统MSMEG_3435-3436基因功能的初步研究

目的 初步探讨耻垢分枝杆菌(Mycobacterium smegmatis)毒素-抗毒素(toxin-antitoxin,TA)系统基因的功能及其在细菌药物耐受中的作用。方法 利用无水四环素(ATc)诱导穿梭质粒构建毒素基因(MSMEG_3436和MSMEG_6760)表达系统,检测毒素基因表达的抑菌作用。应用CRISPR-Cas12a基因编辑技术构建ΔMSMEG_3435-3436和ΔMSMEG_6762-6760敲除菌株,探究毒素-抗毒素系统对菌株生长的影响。通过计算菌株存活率检测MSMEG_3435-3436基因对异烟肼(96μg/ml)和利福平(40μg/ml)的耐受相关性。在耻垢分枝杆菌中用LacZ报告基因分别替换毒素-抗毒素基因(MSMEG_1277-1278、 MSMEG_1283-1284、 MSMEG_3435-3436、 MSMEG_4447-4448和MSMEG_5635-5634),构建5个启动子活性检测突变菌株(SY3328、SY3309、SY6407、SY3310和SY3311),并将pMV261空载体和pMV261-抗毒素系列质粒分别电转至5个突变菌株中,通过测定吸光度值(A₆₀₀、A₅₅₀和A₄₂₀)计算β-半乳糖苷酶活性[酶活性单位为“Miller单位(MU)”],以检测毒素抗毒素系统的启动子活性。结果 在耻垢分枝杆菌中,ATc诱导表达毒素基因MSMEG_3436可抑制细菌生长,而同时表达对应的抗毒素基因MSMEG_3435可消除抑制作用;ATc诱导表达毒素基因MSMEG_6760未发现明显的抑菌作用。与野生株相比,ΔMSMEG_3435-3436和ΔMSMEG_6762-6760敲除菌株在7H9液体培养基中生长表型无明显差异。野生株和ΔMSMEG_3435-3436敲除菌株经异烟肼和利福平处理后的存活率[分别为(4.38±1.48)%和(3.49±0.66)%,(0.15±0.04)%和(0.03±0.02)%]显示毒素-抗毒素基因MSMEG_3435-3436与药物耐受性无关(t=0.548,P=0.613;t=2.663,P=0.056)。启动子(SY3328、SY3309、SY6407、SY3310和SY3311)在携带pMV261-空载体和pMV261抗毒素表达质粒的报告菌株中的β-半乳糖苷酶活性分别为(376.50±17.13)和(315.50±20.71)、(189.00±12.24)和(160.70±9.89)、(225.20±9.95)和(211.70±2.57)、(221.40±12.07)和(186.60±13.17)、(179.10±5.87)和(127.70±19.21)MU,差异均无统计学意义(t=2.272,P=0.086;t=1.795,P=0.147;t=1.319,P=0.258;t=1.949,P=0.123;t=2.562,P=0.063)。结论 成功构建了MSMEG_3435-3436和MSMEG_6762-6760在耻垢分枝杆菌中的诱导表达体系及敲除菌株,并发现MSMEG_3435-3436是一个新的有功能的毒素-抗毒素系统,以及这两个毒素-抗毒素系统与菌株生长表型及异烟肼和利福平耐受性无关,最后发现耻垢分枝杆菌中5对毒素-抗毒素系统的抗毒素基因可能在自身启动子调控中不发挥关键作用,可为进一步研究结核分枝杆菌毒素-抗毒素系统的功能提供线索。     

结核分枝杆菌Rv1512基因的特异性和克隆表达

目的鉴定结核分枝杆菌Rv1512基因的特异性,克隆表达该基因并获得其重组蛋白。方法设计Rv1512基因的特异性引物,并鉴定其特异性。构建pET30a（＋）：Rv1512重组质粒,阳性克隆转化入大肠杆菌BL21。经Ni＋-NTA层析柱纯化融合蛋白,通过SDS-PAGE鉴定该蛋白及其纯度。结果结核分枝杆菌Rv1512基因的特异性被证实;经测序分析证实Rv1512原核表达质粒构建正确,SDS-PAGE结果显示在40 kD处呈现单一蛋白条带。结论结核分枝杆菌Rv1512基因具有较好的特异性;成功构建表达载体pET30a（＋）：Rv1512并获得重组蛋白,为辅助诊断结核分枝杆菌的感染奠定基础。