结核杆菌体内诱导基因的筛选及初步分析

目的筛选结核杆菌在人体内诱导表达的基因，进而作为候选的免疫及药物分子新靶位。方法构建结核杆菌基因组表达文库，应用体内诱导的抗原技术，用吸收过的结核患者血清筛选文库，对阳性克隆测序得到开放阅读框（ORF）。结果实验共确定r51个ORF。按照功能分为8类：毒力、解毒及调节相关基因1个，细胞壁与细胞处理相关基因13个，中间代谢和呼吸相关基因11个，脂类代谢基因7个，信号通路基泪2个，PE／PPE蛋白家族基因3个，保守假设蛋白基因12个，与牛型分枝杆菌同源的保守假设蛋白基因2个。结论应用体内诱导抗原技术可以筛选到结核杆菌进入人体后诱导表达的基因，其中部分基因可以作为结核病预防、诊断和治疗研究的候选靶位。     

噬菌体硝酸盐还原实验方法的建立与评估

目的采用噬菌体与硝酸盐还原试验结合的技术,以期建立一种新的快速、简易、廉价的结核杆菌药敏检测方法。方法对49株结核杆菌的临床分离株以噬菌体硝酸盐还原试验（PhaB-NRA法）与改良罗氏绝对浓度法对结核杆菌进行利福平、异烟肼药物敏感性测定,以绝对浓度法作为参照标准判定PhaB-NRA法的敏感性、特异性、准确性及其可行性。结果PhaB—NRA法对利福平进行药物敏感性测定的敏感性、特异性、准确性分别为89．1％、9167％、89_8％;对异烟肼进行药物敏感性测定的敏感性、特异性、准确性分别为86．21％、90．0％、87．8％。它们与绝对浓度法的符合率分别为利福平：0．746,异烟肼：0．750。结论PhaB-NRA法简化了实验步骤,缩短了药敏检测时间,且无需昂贵的仪器,有望成为快速结核杆菌药物敏感性测定的初筛方法。     

肺癌患者血清氧化／抗氧化状态的初步研究

目的通过对141例原发性肺癌患者血清中抗氧化酶和氧化代谢产物的测定,观察肺癌患者氧化／抗氧化状态的特点,为补充或完善肺癌发生和发展机制提供依据。方法用比色法测定患者的氧化／抗氧化酶的活性、含量,包括：总抗氧化能力（total antioxidant capacity,TAOC）、总超氧化物歧化酶（total superoxide dismutase,TSOD）（包括MnSOD和CuZnSOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（glutathione peroxidase,GPx）、过氧化氢（hydrogen peroxide,H2O2）、丙二醛（malonaldehyde,MDA）。结果（1）肺癌患者氧化／抗氧化状态的特点：与对照组相比,肺癌患者血清中TAOC、MnSOD和GPx明显降低,CuZnSOD、H2O2、MDA明显增高（P〈0．01）。（2）肺癌患者氧化／抗氧化的影响因素：①肺腺癌、小细胞癌组血清H2O2高于肺鳞癌组（P〈0．05）。②不同分化程度组间无显著性差异（P〉0．05）。③Ⅳ期TSOD较I期患者增高（P〈0．01）。结论肺癌患者存在着氧化,抗氧化失衡,其特点为血清中,除CuZnSOD外,抗氧化酶活性降低,氧化代谢产物增高。不同组织学类型及TNM分期对肺癌患者氧似抗氧化失衡有一定的作用。     

γ-干扰素释放试验中两种细胞计数方法的对比分析

目的比较Muse Cell Analyzer自动细胞分析仪和显微镜人工镜检两种计数方法对外周血单个核细胞(PBMC)悬液的计数结果,探讨Muse Cell Analyzer自动细胞分析仪用于γ-干扰素释放试验(T-SPOT.TB)中细胞定量的可行性。方法随机抽取T-SPOT.TB检测中的60份血液标本,对其外周血单个核细胞悬液,分别用人工显微镜和Muse Cell Analyzer自动细胞分析仪计数PBMC,同时进行T-SPOT.TB检测,对结果进行比较分析。结果人工显微镜和Muse Cell Analyzer自动细胞分析仪两种计数方法相关性好(r=0.967);细胞悬液用人工显微镜计数所得PBMC浓度为(6.03±2.18)×109/L,用Muse Cell Analyzer自动细胞分析仪计数所得PBMC浓度为(6.10±2.34)×109/L,两者比较差异无统计学意义(P>0.05);按两种计数方法所得T-SPOT.TB检测结果一致性好。结论 Muse cell analyzer自动细胞分析仪计数可取代人工显微镜计数法用于T-SPOT.TB检测中对细胞悬液中PBMC的计数。     

不同抗原酶联免疫斑点检测技术对结核性胸膜炎辅助诊断价值的比较

目的 探讨结核分枝杆菌不同抗原的酶联免疫斑点检测技术(ELISPOT)对结核性胸膜炎的辅助诊断价值.方法 分离55例结核性胸膜炎患者和43例恶性胸腔积液患者的胸腔积液单个核细胞(PEMCs),经早期分泌抗原靶6 kD(ESAT-6)、培养滤液蛋白10 kD (CFP-10)、ESAT-6/CFP-10融合蛋白(E/C)...     

不同抗原的酶联免疫斑点检测技术对结核病的辅助诊断价值比较

目的比较不同MTB抗原的酶联免疫斑点检测技术（ELISPOT）,探索其对活动性结核病的辅助诊断价值。方法对结核组132例和对照组90例观察对象应用PPD、克隆表达的早期分泌抗原靶6000（ESAT-6）和ESAT-6／培养滤液蛋白10000（CFP-10）融合蛋白（简称E／C）进行酶联免疫斑点检测（ELISPOT）,检测外周血单个核细胞（PBMC）中经3种抗原刺激后斑点形成细胞（SFC）的数量;对照组同时进行PPD试验。计量资料用中位数（四分位间距）表示,计量资料的比较采用Mann-Whitney u检验,计数资料的比较采用X^2检验。结果结核组PPD—ELISPOT、E／C—ELISPOT、ESAT-6-ELISPOT形成的SFC数分别为255（93～526）、148（40～354）和28（10～116）,均明显高于对照组的10（5～41）、10（0～20）和5（0～15）,差异均有统计学意义（U值为1390．5～2510．5,均（P〈0．01）;E／C—ELISPOT和PPD-ELISPOT的敏感度分别为90．3％和84．8％,均明显高于ESAT-6-ELISPOT（62．1％）,差异均有统计学意义（X^2值分别为17．496和28．541,均P〈0．01）;E／C—ELISPOT和ESAT-6-ELISPOT的特异度分别为8414％和88．9％,均明显高于PPD—ELISPOT（68．9％）,差异均有统计学意义（膏值分别为6087和10．808,P〈0．05和P〈0．01）。结论E／C-ELISPOT有可能作为辅助诊断结核病的方法,但其特异度易受MTB潜伏感染的影响。     

涂阳肺结核患者密切接触者结核感染及危险因素分析

目的了解涂阳肺结核患者密切接触者结核感染情况及影响因素。方法采用T-SPOT.TB试剂盒检测与76例涂阳肺结核患者的243例密切接触者结核潜伏感染(LTBI)情况,采用Pearsonχ2检验分析LTBI的影响因素。结果 248例密切接触者中活动性肺结核检出率为2.02%,在243例密切接触者(剔除5例活动性肺结核患者)中T-SPOT.TB的阳性率为46.9%,经单因素分析显示于涂阳肺结核患者确诊前2个月内接触者及夫妻关系的密切接触者,LTBI危险性高,且差异有统计学意——分别为(χ2=6.925,P=0.006)和(χ2=8.447,P=0.038)。结论与涂阳肺结核患者密切接触者较普通人群结核感染发生率高,且不同接触人群LTBI发生比率不同。     

北京市昌平区某高校大学新生结核潜伏感染调查

目的 调查大学新生结核潜伏感染情况,以便采取预防性措施。 方法 2010年10月随机纳入北京市昌平区某高校入学新生TST≥10 mm的健康受试者420例,应用ELISPOT检测经抗原刺激后分泌IFN-γ的效应T淋巴细胞(即斑点形成细胞,SFCs)数量,并对ELISPOT阳性者进行为期3年的结核感染发病情况监测。 结果 ELISPOT检测LTBI总的阳性率为41.2%,在BCG接种(阳性率41.5%)和未接种(阳性率40.0%)中差异无统计学意义(χ²=0.064, P=0.447),在TST直径10~14、15~19和≥20 mm组间(37.6%、45.4%和64.3%)差异有统计学意义(χ²=8.408, P=0.015),173例未治疗的 ELISPOT+/TST+者经3年的ATB监测,发病率为0。 结论 北京市昌平区某高校大学新生LTBI比率高,但仅以ELISPOT和TST双阳性者为预防性治疗指标,尚不足够。     

乙酰丙酸-十二烷基硫酸钠对结核分枝杆菌的杀灭作用及其杀菌机制的蛋白组学研究

目的 研究消毒剂乙酰丙酸-十二烷基硫酸钠（LVA-SDS）对结核分枝杆菌标准株H37Rv的杀灭作用,并对其在蛋白质水平的杀菌机制进行研究。方法 按照2002年版卫生部《消毒技术规范》要求,首先采用悬液定量杀菌试验,观察LVA-SDS对结核分枝杆菌H37Rv是否存在杀灭作用;然后采用Label-free定量蛋白质组学技术筛选3次独立重复的实验组（LVA-SDS与结核分枝杆菌H37Rv的菌悬液接触30 min）和对照组的差异表达蛋白,通过生物信息学分析差异蛋白之间的相互作用,利用Western blot验证差异蛋白。结果 20% LVA+2% SDS消毒剂对结核分枝杆菌H37Rv有较好的杀灭作用;筛选差异表达蛋白414种（P<0.05）,其中44种蛋白表达上调,370种蛋白表达下调。蛋白相互作用发现异柠檬酸裂解酶（ICL）等14种蛋白处于相互作用网络关键节点。Western blot验证结果显示免疫蛋白印记与定量比较蛋白组学实验结果有较好的可重复性。结论 LVA-SDS对结核分枝杆菌确实存在很好的杀灭作用;差异蛋白的发现有助于了解LVA-SDS对结核分枝杆菌的杀菌机制,为新型抗结核药物和消毒剂的研发提供新的分子标识。     

结核分枝杆菌glcB基因原核表达质粒的构建、表达和纯化

目的构建结核分枝杆菌glcB基因原核表达工程株,并进行表达、纯化。方法用PCR 扩增结核分枝杆菌glcB基因, 并克隆入pTA2质粒。测序正确后, 再亚克隆入pET30a(+)质粒, 构建pET30a(+):glcB重组体,转化宿主菌大肠埃希菌BL21 (DE3)。结果结核分枝杆菌glcB基因工程株经0.4mM异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导后,表达出相对分子质量为92kD重组蛋白。SDS-PAGE 分析显示,IPTG诱导4h重组蛋白的表达量最高。表达蛋白以包涵体形式存在于胞质中, 表达量占全菌蛋白质的50％。经Ni-NTA 柱纯化,获得纯度为90%的重组蛋白。结论成功地构建了结核分枝杆菌glcB基因工程表达株,并获得GlcB重组蛋白, 为研究新型血清学诊断活动性结核病奠定了基础。