颗粒溶素重组表达载体的构建和原核表达

目的：构建人颗粒溶素（Granulysin,GNLY）基因的表达载体并在大肠杆菌中表达。方法：抽提体外培养的单个核细胞总RNA,通过RT-PCR的方法获得含有222bp的颗粒溶素cDNA,克隆到pMD18-T载体,测序正确后再亚克隆到质粒pET28a（＋）中,构建重组表达质粒pET28a（＋）-GNLY,在大肠杆菌中诱导表达并经Ni亲和层析纯化。用SDS-PAGE和Westernblot对表达产物进行鉴定。采用MTT法检测GNLY融合蛋白的生物学活性。结果：酶切结果证实,成功地构建了GN-LY原核表达载体,并在大肠杆菌中获得稳定的表达,表达产物的相对分子质量（Mr）同预期值相一致。结论：成功构建了重组表达质粒pET28a（＋）-GNLY,并在大肠杆菌BL21（DE3）plysS中表达,获得了具有良好的抗原性和特异性的GNLY融合蛋白,为下一步研究人GNLY的功能奠定了基础。     

PBC患者granulysin基因和蛋白的表达及临床意义

目的:探讨颗粒溶素(granulysin,GNLY)在原发性胆汁性肝硬化和患者(PBC)中的表达及其意义.方法:采用TaqMan探针技术,以18SrRNA为内参照,测定60例PBC患者外周血中GNLYmRNA的含量,同时应用酶联免疫吸附法(ELISA),检测PBC患者血清中GNLY蛋白的水平,并以健康体检组(n=100)和乙型肝炎肝硬化组(n=60)为对照.结果:PBC组GNLYmRNA的平均拷贝数显著高于健康对照组[(2.7±2.5)×108vs(3.0±1.9)×107,P<0.01]和乙型肝炎后肝硬化组[(2.7±2.5)×108vs(4.7±3.6)×105,P<0.001).PBC患者血清中的GNLY蛋白表达显著高于健康对照组(15.48±3.24μg/Lvs4.76±2.32μg/L,P<0.01)和乙型肝炎后肝硬化组(15.48±3.24μg/Lvs2.57±1.84μg/L,P<0.01).结论:GNLY的表达与PBC的发生、发展存在一定的相关性,可用于PBC临床诊断.     

结核杆菌抗原Ag85C的HLA-A*0201限制性CD8+CTL表位的预测及鉴定

目的:预测及鉴定结核杆菌(Mycobacterium tuberculosis, Mtb)抗原Ag85C的HLA-A*0201限制性CD8 CTL表位,为基于表位的结核疫苗研究提供依据.方法:应用SYFPEITHI数据库预测结核杆菌抗原Ag85C序列中可能存在的HLA-A*0201限制性T细胞表位,利用T2细胞株分析各预测的抗原肽与HLA-A*0201分子的亲合力,选取高亲合力肽诱导特异性CTL细胞,检测各高亲合力肽刺激其特异性CTL细胞分泌的IFN-γ水平、在体外的CTL增殖反应以及细胞杀伤毒性,逐步鉴定出Ag85C的HLA-A*0201限制性CD8 CTL表位.结果:SYFPEITHI数据库从Ag85C序列中预测到14条能够结合HLA-A*0201分子的抗原肽,其中3个抗原肽(170～178 aa、317～325 aa和144～153 aa)显示与T2细胞上HLA-A*0201分子有高结合力,而抗原肽FLTREMPAWL(144～153 aa)能够诱导大多数HLA-A*0201阳性结核患者及PPD( )健康志愿者产生特异性CTL细胞,并分泌大量的IFN-γ,能够诱导CTL体外发生增殖,能够产生特异性杀伤活性.结论:成功鉴定出抗原肽FLTREMPAWL(144～153 aa)结核杆菌抗原Ag85C的HLA-A*0201限制性CD8 CTL表位,可作为结核疫苗设计的候选表位,为进一步研发新型有效的抗结核疫苗奠定了基础.     

隐球菌保护性肽表位GMFDGLSGV多聚体重组表达及鉴定

目的重组表达隐球菌保护性肽表位GMFDGLSGV二聚体、四聚体、八聚体，以进一步探讨其免疫效应。方法选取隐球菌抗原表位GMFDGLSGV，引入Th表位PADRE及木马肽序列（RKKRRQRRR），并以RVKR序列作为接头，分别合成隐球菌保护性肽表位GMFDGLSGV二聚体、四聚体、八聚体全基因序列，经PCR扩增后分别插入融合表达载体pGEX-4T-1，将重组质粒转入大肠埃希氏菌BL21并以IPTG诱导表达，进一步经GST亲舍层析柱纯化，经SDS-PAGE和Western—blot鉴定重组表达蛋白。结果成功构建了隐球菌保护性表位GMFDGLSGV二聚体、四聚体、八聚体的表达质粒，并经IPTG诱导表达了大小约为32000，36000，42000的融合蛋白。结论隐球菌保护性肽表位GMFDGLSGV多聚体的重组表达为进一步开发隐球菌疫苗提供有价值的依据。     

抗α-胞衬蛋白抗体对干燥综合征的诊断价值:一项meta分析

目的探讨抗α-胞衬蛋白抗体对干燥综合征(SS)的诊断价值。方法对已经发表的采用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测抗α-胞衬蛋白抗体诊断SS(以2002年国际标准为诊断依据)的文献进行了分析,并且采用随机效应模型分析了ELISA检测抗α-胞衬蛋白抗体对SS的总体诊断敏感性、特异性、阳性似然比(PLR)、阴性似然比(NLR)和诊断优势比(DOR)。以汇总受试者工作特征(sROC)曲线分析抗α-胞衬蛋白抗体的总体诊断性能。结果最终有7项研究进入了本次meta分析,ELISA检测抗α-胞衬蛋白抗体IgA、IgG的总体诊断敏感性[95%可信区间(CI)]分别为0.30(0.25～0.34)和0.32(0.28～0.36),总体特异性分别为0.90(0.87～0.93)和0.83(0.80～0.86)。已有的研究质量并不高,且之间存在较大的异质性。结论抗α-胞衬蛋白抗体对SS具有较高的诊断特异性,但其诊断敏感性并不理想。对抗α-胞衬蛋白抗体的结果解释应建立在患者临床特征之上。     

结核杆菌Ag85A重组蛋白的免疫原性研究

目的探讨纯化的结核杆菌Ag85A重组蛋白激发细胞毒性T淋巴细胞(Cytotoxic T lymphocyte,CTL)免疫应答的能力,为新型结核疫苗的设计打下基础。方法通过细胞增殖和细胞毒性实验,研究纯化的重组表达Ag85A蛋白刺激外周血单个核细胞(PBMC)产生的增殖反应和细胞毒活性,初步鉴定Ag85A重组蛋白的免疫原性。结果以刺激系数(SI)>3为界,Ag85A重组蛋白(10μΜ)能刺激全部12例HL-A*0201阳性(A2 )结核菌素阳性(PPD )健康个体的PBMC发生增殖(平均SI为56.2±3.6);增殖反应明显高于PPD(平均SI为13.7±3.5)引起的细胞增殖反应(P<0.01)。在Ag85A重组蛋白诱导的CTL细胞毒活性分析中以负载抗原肽(10μΜ)的T2细胞作为靶细胞,Ag85A重组蛋白诱导的CTL作为效应细胞,Ag85A重组蛋白能诱导全部的12例A2 PPD( )健康个体中CTL杀伤活性,平均活性分别为(85.2±8.5%),显著高于PPD〔(平均为(21.6±1.7%)〕(P<0.01)诱导的CTL杀伤活性。结论本研究得到的重组优化Ag85A蛋白具有较好的免疫原性,能有效刺激PBMC产生细胞增殖反应和细胞毒活性,为进一步开发有效的结核疫苗打下了基础。     

急性乙型肝炎患者外周血单个核细胞颗粒溶素mRNA定量测定及临床意义

目的应用实时荧光定量逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测乙型肝炎(简称乙肝)患者外周血单个核细胞(PBMC)中颗粒溶素(GNLY)mRNA的表达,探讨GNLY基因表达水平与急性乙肝的关系。方法实时荧光定量RT-PCR分别检测40例急性乙肝患者及100名正常对照的PBMC的GNLY基因表达水平,同时检测血清丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天冬氨酸氨基转移酶(AST)水平。结果急性乙肝患者发病期mRNA表达显著高于正常对照组(P<0.01),恢复期GNLY基因表达与正常对照组差异无统计学意义(P>0.05)。乙肝患者GNLYmRNA与血清ALT、AST呈正相关。结论实时荧光定量RT-PCR检测GNLY mRNA的表达准确可靠。患者外周血GNLY基因表达水平与急性乙肝的发生发展存在一定的相关性。     

穿孔素在隐球菌性脑膜炎患者外周血单个核细胞的表达及临床意义

目的 研究隐球菌性脑膜炎(cryptococcal meningitis)患者外周血单个核细胞中穿孔素(perforin,又称pore-form-ing protein,PFP)表达及其与细胞因子的关系.方法 首先用密度梯度离心法分离得到25例隐球菌性脑膜炎患者和30例健康人外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cells,PBMC),其次用免疫印迹(western blot)的方法检测其中的PFP的蛋白含量,用实时荧光定量(RFQ)-PCR方法测定其中PFP的mRNA含量,并分析隐球菌性脑膜炎患者蛋白含量与细胞因子浓度的相关性.结果 与健康对照组比较,隐球菌性脑膜炎患者PBMC中PFP蛋白含量和mRNA均明显降低,PFP蛋白表达水平与IL-10,IFN-γ水平均无相关性.结论 PFP可能参与隐球菌性脑膜炎的疾病进程,这为探讨隐球菌性脑膜炎的病情监控和有效治疗提供了新的线索.     

人颗粒溶素的克隆、原核表达及其抗体制备

目的构建人颗粒溶素（GNLY）质粒,进行原核表达,纯化得到相对分子质量9 000目的片段,免疫新西兰大白兔得到兔抗GNLY多克隆抗体。方法分离外周血单个核细胞,用卡介苗和白细胞介素-2（IL-2）刺激,培养12 d。抽提细胞RNA,通过逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）获得含有222 bp的GNLY cDNA,克隆到pMD18-T载体,测序正确后再亚克隆到质粒pET28a（＋）中,得到重组质粒pET28a（＋）-GNLY并将其转化大肠杆菌,诱导表达后用镍（Ni）亲和层析纯化,十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）和免疫印迹试验（Westernblot）进行鉴定。用纯化的蛋白免疫新西兰大白兔,得到抗-GNLY特异性多抗。结果成功构建了pET28a（＋）-GNLY表达质粒。用大肠杆菌表达带6个组氨酸的融合蛋白并进行纯化,最后免疫兔得到抗-GNLY特异性多抗,并经Western blot验证正确。结论获得了纯化的GNLY蛋白和抗-GNLY多抗血清,为今后对疾病中细胞毒性T淋巴细胞（CTL）和自然杀伤（NK）细胞活性的研究打下了基础。     

血清IgE升高在自身免疫性胰腺炎患者中的临床意义

目的探讨血清免疫球蛋白E(IgE)升高在自身免疫性胰腺炎患者(AIP)中的临床意义。方法检测63例AIP患者及30例健康体检者血清IgE、IgG、IgG4、补体、球蛋白、嗜酸性粒细胞百分比(EOS%)及自身抗体水平,评估上述指标与AIP并发过敏性疾病或并发糖尿病的关系。结果在63例AIP患者中,IgE、IgG、IgG4、球蛋白异常的比例分别为58.7%、58.7%、74.6%、61.9%,均超过50.0%;EOS%升高、C3降低、C4降低、自身抗体阳性、并发过敏性疾病和并发糖尿病的患者比例分别为25.4%、31.7%、34.9%、25.4%、15.9%和47.6%。而在37例IgE增高的AIP患者中,其IgG、IgG4、球蛋白异常的比例分别为59.5%、89.2%、62.2%,均超过50.0%;EOS%升高、C3降低、C4降低、自身抗体阳性、并发过敏性疾病和并发糖尿病的患者比例分别为29.7%、35.1%、35.1%、29.7%、18.9%和51.4%。IgE与IgG4呈正相关,与C4呈负相关(r=0.404、-0.294,P0.05);IgE与EOS%、C3无相关性(r=0.132,P=0.303;r=-0.255,P=0.080);IgE与IgG及IgG4之间无相关性(r=0.021,P=0.873;r=0.089,P=0.490)。IgE在自身抗体阳性或阴性、并发或未并发过敏性疾病,以及并发或未并发糖尿病患者之间差异均无统计学意义(P0.05)。结论血清IgE可能与过敏机制一起参与了AIP及胰源性糖尿病的发病,是潜在的诊断及监测AIP病情的实验室指标。