MALDI-TOF-MS检测人群中骨形成蛋白4基因编码区突变方法的建立

目的：应用基质辅助激光解吸电离-飞行时间质谱（MALDI-TOF-MS）技术建立检测人群中骨形成蛋白4（BMP4）基因编码区突变的平台。方法：采用PCR扩增BMP4基因,产物纯化后利用MALDI-TOF-MS技术对广东籍100例非综合征型唇腭裂患儿及91例健康对照者外周血进行BMP4基因突变的检测并进行测序验证。结果：采用MALDI-TOF-MS平台检测的191份样本均未发现BMP4基因编码区存在T102A、R162Q及R198X突变,与测序结果一致。结论：成功建立基于MALDI-TOF-MS检测BMP4基因编码区突变的平台,该方法具有高通量、快速、准确的特点。     

ADV-tk重组腺病毒的构建及检测

目的应用基因重组技术,构建含胸苷激酶（tk）自杀基因的复制缺陷型腺病毒（ADV-tk）,为进一步研究tk自杀基因对肿瘤的抑制作用奠定基础。方法采用细胞内同源重组法构建携带tk基因的ADV-tk,经PCR鉴定正确后进行扩增、纯化和滴度测定。重组腺病毒ADV-tk体外转染人肝癌SMMC-7721细胞,RT-PCR检测tk基因的整合和表达。建立裸鼠人肝癌动物模型,腹腔注射ADV-tk,荧光显微技术观察ADV-tk基因在肝脏的转染情况和对肿瘤细胞的抑制作用。结果构建的重组腺病毒中带有tk基因,经扩增、纯化后测得重组腺病毒滴度为1.4×10^10pfu/ml。ADV-tk体外转染SMMC-7721细胞后,RT-PCR检测显示tk基因在细胞中整合并且有效表达。体内检测结果发现ADV-tk在肝脏有明显转染,肿瘤组织中凋亡细胞明显增多。结论本研究构建的携带tk基因的复制缺陷型腺病毒获得成功,可用于下一步研究。     

限制能量摄入对大鼠胰岛细胞衰老及胰岛素表达的影响

目的 探讨限制能量摄人对大鼠胰岛细胞衰老及胰岛素表达的影响.方法 18月龄SD大鼠经过限制能量摄入(给予正常饮食量的60%)6个月,建立限制能量摄入动物模型.取限制能量摄人组(实验组)及对照组胰腺,行β-半乳糖苷酶(SA-β-Gal)染色并检测胰岛内p16的表达,以了解胰岛细胞衰老状态;同时检测胰岛B细胞胰岛素的表达.结果 实验组与对照组比较,胰岛内p16表达减少,分别为(0.19130±0.02852)个和(0.24526±0.03191)/p,差异有统计学意义(P＜0.01);胰岛内β-Gal染色阳性率分别为84%和100%(P＜0.01)、着色面积1.672和2.118(P＜0.05)、着色程度1.725和2.412(P＜0.05);胰岛素表达增加(201.7±35.3和187.8±26.0),差异有统计学意义(P＜0.05)结论限制能量摄入可延缓胰岛B细胞衰老,改善胰岛的分泌功能.     

阴道毛滴虫RRas同源基因的克隆和序列分析

目的 克隆和分析阴道毛滴虫RRas同源基因，以探讨其在细胞内信号传导通路中的功能。 方法 从已构建的阴道毛滴虫cDNA表达文库中分离得到一个与人类RRas同源的cDNA克隆，用PCR扩增该cDNA克隆TvRRas相对应的基因组DNA，并对cDNA克隆及其对应的基因组DNA进行测序。利用BLASTP，RPS-BLAST和ClustalW等工具进行序列分析。 结果 TvRRas cDNA序列全长705对碱基，读码框含615对碱基，推测蛋白质序列具205个氨基酸。序列分析显示该基因的基因组DNA序列含有5′端ATG起始密码子和3′端的终止密码子，与cDNA序列完全一致，提示该基因无内含子；进一步分析表明该基因系RRas亚家族的同源基因，其氨基酸序列与人类和小鼠的RRas同源性最高（两者的一致性均为51%，相似性均为70%），同时拥有人类RRas基因高度保守的结合GTP的结构域和完全一致的效应结构域。进化树分析表明该基因与人类的RAS原癌蛋白基因分支及RRas分支聚类。 结论 获得了阴道毛滴虫RRas同源基因。     

酵母双杂交诱饵蛋白LASS1融合表达质粒的构建及鉴定

目的 构建酵母双杂交系统诱饵蛋白大鼠LASS1融合表达质粒,为进一步筛选大鼠脑神经元内与LASS1p相互作用的蛋白奠定基础.方法 应用PCR方法获得大鼠LASS1基因2个片段,分别克隆入酵母双杂交系统诱饵蛋白质粒载体pGBKT7,转染酵母菌AH109并检测重组质粒的自激活现象及毒性.利用Western印迹检测重组质粒在AH109的表达情况.结果 LASS1基因的PCR产物片段大小分别为Flag(111 bp)、Slag(109 bp);Western印迹结果表明2个重组质粒表达的蛋白均可以与抗c-Myc抗体在22 kU处特异性反应;重组质粒转化酵母后无自激活作用.结论 重组质粒pGBKT7-Flag、pGBKT7-Slag均能够在AH109内正确表达,可作为酵母双杂交系统诱饵蛋白使用.     

单管扩增测序分型技术用于人类白细胞抗原-DRBl基因分型的研究

目的：用单管PCR扩增方法建立高效的人类白细胞抗原（HLA）-DRBl基因测序分型技术并探讨其应用价值。方法：合成7个5＇端特异性扩增引物和一个3’端共用引物，将上述引物混合在一起组成单个PCR反应用于120个临床样本的HLA-DRB1的DNA测序分型。结果：本组样本都能成功分型，且结果准确，重复性好。结论：本法改进了测序分型技术，具有高分辨率、高特异性和高效率的特点，值得推广应用。     

特发性肺纤维化病人肺成纤维细胞过度表达单核细胞趋化蛋白-1

目的研究凝血酶对正常人肺成纤维细胞（normalhuman lung fibroblasts,N-LF）和特发性肺纤维化（idiopathic pulmonary fibrosis,IPF）病人肺成纤维细胞（F-LF）单核细胞趋化蛋白-1（MCP-1）表达的影响。方法 N-LF和F-LF细胞分别培养于96孔培养板内,凝血酶诱导4和24h后,收集上清液并用ELISA方法检测MCP-1蛋白水平。结果凝血酶可诱导N-LF和F-LF细胞释放MCP-1,但F-LF细胞的MCP-1分泌水平远远高于N-LF细胞。结论人肺成纤维细胞在肺纤维化过程中过度合成和释放MCP-1,凝血酶可进一步促进其过度表达MCP-1。     

LPA2受体介导LPA诱导的人支气管肺上皮细胞PAI-1表达

目的研究溶血磷脂酸（LPA）对原代培养人支气管肺上皮细胞（NHBE）表达纤溶酶原激活物抑制因子-1（PAI-1）的调节作用。方法原代培养人支气管上皮细胞培养于6孔板培养板内,经LPA诱导后,收取RNA裂解液并用实时荧光定量RT-PCR技术检测PAI-1 mRNA表达水平;利用RNA干扰技术研究LPA受体的作用。结果 LPA可诱导NHBE细胞PAI-1 mRNA表达上调且呈时间相关性,此效应可被LPA2 siRNA完全阻断。结论 LPA2受体介导LPA诱导NHBE细胞表达PAI-1。     

LASS1基因在鼠脑皮层中的表达研究

目的 探讨LASS1基因在大脑衰老中的作用。方法 分别从胎鼠、新生鼠、1月龄、3月龄、6月龄、11月龄、18月龄和24月龄鼠大脑皮层组织提取总RNA，RT—PCR扩增获得LASSI的cDNA片段并植入pGEM-T载体，以重组质粒载体为定量标准模板，采用Taqman荧光探针，一步法实时定量RT—PCR检测LASS1 mRNA表达，并以肌动蛋白基因（B—actin）和18S rKNA基因作为看家基因。结果在胎鼠至青壮年鼠（1—3个月龄）发育过程中大鼠脑皮层LASS1表达水平呈上调趋势，之后随年龄增长逐渐下降；β—actin表达量在胎鼠厦新生鼠明显高于成年鼠和老年鼠；18S rRNA基因表达相对稳定。结论成功建立了大鼠LASS1基因表达的荧光实时定量RT—PCR检测方法；大鼠脑皮层中LASS1基因转录水平随年龄变化呈现相应的规律性，这将为进一步研究该基因在衰老过程中的作用提供实验室依据；同时，作为看家基因用于衰老研究，18Sr RNA较β-acfin基因更为可靠。     

四川彝族的起源初探--来自人类白细胞抗原-B基因的线索

目的：根据人类白细胞抗原（HLA）-B基因频率，探讨四川彝族的民族起源。方法：收集四川彝族群体的HLA-B基因频率和已报道国内其他主要民族人群的札A-B基因数据，运用唧口对HLA-B数据进行聚类分析。主成分分析由SPSS11．0完成。结果：从聚类树型结构图可知。我国主要民族明显分为南北两大群，四川彝族虽处于北方人群一组。但在遗传距离上介于南北方人群之间。主成分分析发现。彝族处于汉藏语系群体之中。与藏族群体关系最近。结论：从HLA-B基因的角度分析。四川彝族的HLA-B遗传特征表现为源于北方，与藏族关系密切。