日本血吸虫生长激素诱导的跨膜蛋白(GHITM)基因克隆与表达

<正>目的:课题组前期研究已经筛选出日本血吸虫肺期童虫的差异基因-生长激素诱导的跨膜蛋白(GHITM)基因,其可能在日本血吸虫的生长发育中起关键作用。本文克隆、表达GHITM基因,以便进一步探索其在血吸虫生长发育过程中的作用。方法:根据GHITM基因的序列,分别设计含有酶切位点的GHITM基因引物,以日本血吸虫成虫的总RNA为模板进行RT-PCR,PCR产物提纯后使用EcoR I和XhoI双酶切,然后与使用同样酶双酶切的pET-28a-c质粒连接并转化DH5α宿主菌,使用卡那霉素筛选阳性克隆后测序。     

正交试验法筛选日本血吸虫细胞的培养条件

目的　筛选日本血吸虫成虫细胞的培养条件及评价细胞培养条件优劣的指标。方法　以琥珀酸脱氢酶(SDH)、乳酸脱氢酶(L DH)和葡萄糖- 6 -磷酸脱氢酶(G- 6 - PDH )为指标,运用正交试验法进一步研究合成培养基、细胞外基质和血清浓度3个因素在3个不同水平对虫龄为2 1d的日本血吸虫细胞的影响。培养第5天对日本血吸虫培养细胞进行SDH染色;培养第14天分别进行L DH、G- 6 - PDH染色,Olympus- BH2 显微镜观察并拍照,HPIAS- 2 0 0 0图像分析仪测量其含量,用SPSS10 .0作统计分析。结果　不论以SDH或L DH,还是G- 6 - PDH为指标,均显示RPMI- 16 4 0含2 0 %小牛血清组成的培养基培养接种于肝基质上的日本血吸虫细胞,培养细胞的SDH、L DH、G- 6 -PDH活性最强。血清浓度对培养细胞酶活性的影响最大,其次是细胞外基质(ECM) ,影响最小的是合成培养基。其中,血清浓度对3种酶活性的影响差异均显著;基质对SDH、L DH活性的影响差异显著,而对G- 6 - PDH活性的影响差异不显著;合成培养基的影响均无差异。结论　RPMI- 16 4 0含2 0 %小牛血清组成的培养基培养接种于肝基质上的日本血吸虫细胞,培养细胞的SDH、L DH、G- 6 -PDH活性最强。选择3种酶中任一,均可用来评价日本血吸虫细胞培养条件的优劣。     

日本血吸虫未成熟虫卵卵壳的超微结构

应用透射电镜和扫描电镜观察了日本血吸虫（Ｓｃｈｉｓｔｏｓｏｍａｊａｐｏｎｉｃｕｍ）未成熟虫卵卵壳的超微结构。初产期和胚胎期虫卵卵壳形态结构相似，均有形态多样的微管道贯通卵壳内外，管道内含一些分泌颗粒，管壁由单位膜构成；致密的微棘沿卵壳均匀分布，微棘纵切呈长三角形，横切呈星形，中央有小空腔；卵壳由电子密度低且较厚的外层和电子密度高且较薄的内层构成；卵壳表面有丰富的网样纤维基质。推测卵壳的微管道、微棘和网样纤维基质的形成时期是同步的，皆在雌虫卵模内形成。本文讨论了微管道的结构、功能与意义。     

日本血吸虫培养细胞内糖类物质的动态变化及肝基质对其的影响

目的研究日本血吸虫成虫培养细胞内糖类物质的动态变化以及肝基质培养对其的影响。方法将虫龄为32d的日本血吸虫成虫细胞随机分为2组,实验1组(普通组)细胞接种于普通小盖玻片上,实验2组(肝基质组)细胞接种于预先铺敷有肝基质的盖玻片上,细胞培养基为RPMI-1640(含20%小牛血清附加常量抗生素)。每周取各组细胞进行高碘酸雪夫(PAS)染色和淀粉酶处理后的PAS染色,观察培养细胞内糖类物质的水平及分布变化。在培养第1周和第5周分别取2组染色细胞,用HPIAS-2000图像分析仪测定细胞内代表糖水平的A值,并做统计学分析。结果随着培养时间的延长,实验1组的4种类型细胞的糖水平逐渐减少,细胞内不含糖原;而实验2组细胞的糖原和糖类物质逐渐增加。培养第1周,2组细胞几乎均不含糖原,但实验1组细胞的糖水平高于实验2组,差异有统计学意义(u=7.10,P<0.01)。培养第5周,实验1组细胞糖原仍甚少,而实验2组细胞的糖原水平明显增加(u=9.32,P<0.01);并且实验2组细胞的糖水平显著高于实验1组细胞(u=16.89,P<0.01)。培养过程中,实验1组未见分裂细胞,但实验2组可观察到分裂细胞。结论日本血吸虫培养细胞内糖类物质随培养时间的延长逐渐减少;肝基质能增强培养细胞合成糖物质和生长增殖能力。     

MNNG对日本血吸虫成虫培养细胞糖类物质作用

目的研究甲基硝基亚硝基胍(MNNG)对日本血吸虫成虫培养细胞糖类物质动态的影响.方法将日本血吸虫成虫细胞接种于小盖玻片上,置于RPMI-1640含20%小牛血清附加常量抗生素的常规培养基中培养.培养第4 d,细胞被随机分为实验组和对照组.实验组细胞用含3μg/ml MNNG的常规培养基处理48 h,对照组细胞用不含MNNG的常规培养基作相同处理.细胞经彻底清洗后,继续以常规培养基培养3周,然后换用含5%小牛血清的低血清培养基培养.NNNG处理后第1～8周,每周取实验组和对照组细胞进行高碘酸雪夫(PAS)染色和淀粉酶处理后的PAS染色,观察培养细胞内糖类物质的含量及分布变化.取培养第6周的染色细胞,用HPIAS-2000图像分析仪测定细胞内代表糖含量的吸光度,并作统计学分析.结果随着培养时间的延长,对照组培养细胞的着色逐渐变浅,糖含量逐渐减少;实验组细胞的着色则逐渐加深,糖类物质和糖原含量均增加,与对照组比较,差异有统计学意义(P＜0.01).MNNG处理后第5周,实验组细胞着色最深,核质着色型第二类细胞和分裂细胞数目显著增加.结论MNNG诱导后,日本血吸虫成虫培养细胞内糖原和糖类物质含量均明显增加,分裂细胞增多.     

乙型肝炎急性感染小鼠模型的建立

目的 通过尾静脉注射感染性小鼠血清的方法 建立一种简单复制乙型肝炎急性感染的小鼠模型.方法 收集通过水压法复制第3天的小鼠血清,使用不同剂量尾静脉注射感染同系小鼠.分别在不同的时间阶段检测血清中的HBsAg和HBeAg,肝组织中的HBcAg和血清中HBV的DNA.结果 注射0.1 ml血清的感染组的检测结果 均高于0.2 ml组.结论 通过注射感染血清可以成功地复制急性小鼠感染模型.该模型复制方法 中,感染的结果 与注射感染血清的剂量无关.     

鼠胚胎成纤维细胞饲养层及与鼠尾胶联合促日本血吸虫培养细胞贴壁作用的研究

目的观察鼠胚胎成纤维细胞(MEF)与鼠尾胶及联合对日本血吸虫培养细胞的促贴壁作用。方法灌注法获取21 d虫龄的日本血吸虫虫体,冷消化法制备细胞悬液,调细胞数为1×109／L,并将细胞分别接种于预先铺敷鼠尾胶(鼠尾胶组)、MEF(MEF组)、铺敷鼠尾胶后接种MEF(联合组)和既不铺敷鼠尾胶也不接种MEF(对照组) 的4组培养瓶中培养,培养基为RPMI-1640含20％小牛血清附加常量抗生素。定时计数贴壁细胞数,计算贴壁率。结果随着培养时间从24-48 h,各组日本血吸虫细胞的贴壁率逐渐增高,48 h以后贴壁率开始下降;方差分析显示,同组内不同培养时间细胞贴壁率比较,差异有统计学意义(F=149．22、81．97、232．86、63．05,P<0．01);q检验发现,同组内不同培养时间两两比较差异有统计学意义(P<0．01)。相同培养时间,各组间培养细胞的贴壁率不都相同 (F24=44．65,P<0．01;F48=1 071．489,P<0．01;F72=4 208．35,P<0．01);q检验分析显示,除培养24 h的MEF组与鼠尾胶组细胞的贴壁率差异无统计学意义外(q=0．792,P>0．05),其余两两比较均有统计学意义(P<0．01)。结论 MEF对日本血吸虫培养细胞的贴壁具有促进作用,MEF与鼠尾胶联合对培养细胞的贴壁具有协同作用。     

雄虫抽提物对日本血吸虫卵黄培养细胞最适浓度的筛选

目的筛选雄虫抽提物对日本血吸虫卵黄培养细胞影响的最适作用浓度。方法灌注法获取28 d虫龄的日本血吸虫虫体,无菌处理后分离雌雄虫体。将雄虫匀浆,反复冻融3次,离心取上清液,考马斯亮蓝法测定蛋白后置于-20℃下保存备用。切下雌虫卵黄腺段虫体,冷消化法制备细胞悬液,调整细胞数为1×10~9/L后,将卵黄细胞接种于小盖玻片上,RPMI-1640含20%小牛血清培养,根据加入不同质量浓度雄虫抽提物分为6组(0、10、50、100、150、200mg/L组)。培养第7天,以核仁组织区相关嗜银蛋白(argyrophilic nucleolar organizer region associated proteins,AgNORs)及乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)为评价指标,对卵黄细胞进行AgNORs及LDH染色,Olympus-BH2显微镜观察,输入HPIAS-2000图像分析仪测定培养细胞的灰度值。结果随着雄虫抽提物质量浓度的增加,培养细胞的AgNORs与LDH着色均逐渐加深,至100 mg/L时最深,随后又逐渐变浅。图像分析显示,雄虫抽提物处理的各组细胞AgNORs及LDH均明显高于对照组(q_(10)=14．2189、q_(50)=18．3358、q_(100)= 35．6491、q_(150)=13．1849、q_(200)=13．8604,P＜0．01；q_(10)=10．3377、q_(50)=11．7532、q_(100)=23．1883、q_(150)=10．2792、q_(200)= 9．3052,P＜0．01)。雄虫抽提物100 mg/L组与其他各组比较,AgNORs及LDH明显升高(q_(10)=21．4302、q_(50)= 17．3132、q_(150)=22．4642、q_(200)=21．7887,P＜0．01；q_(10)=12．8506、q_(50)=11．4351、q_(150)=12．8896、q_(200)=13．8831,P＜0．01)。结论雄虫抽提物可显著提高日本血吸虫卵黄细胞的增殖能力与代谢活性,其作用的最适质量浓度为100 mg/L。     

单克隆抗体Dot－ELISA直接法检测血吸虫病循环抗原的现场应用

单克隆抗体Ｄｏｔ－ＥＬＩＳＡ直接法检测血吸虫病循环抗原的现场应用湖北医科大学血吸虫病研究室（武汉４３００７１）倪永晖，陈静卿，蒋明森沙市市血吸虫病防治所黄盘兴近年来应用单克隆抗体（ＭｃＡｂ）检测血吸虫肠相关循环抗原取得了较好的结果￣［１～３］。作者曾...     

日本血吸虫虫体抗原导致的保护性免疫及其免疫特征的分析

本实验分别将日本血吸虫（大陆株）雌、雄、合抱虫体可溶性抗原制剂，佐以卡介苗，一次性皮内免疫小鼠。结果，免疫后的小鼠对血吸虫的攻击产生相当的保护作用（保护率分别为４２．３％、４２．６％和４４．５％）。经ＳＤＳ－ＰＡＧＥ和Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔ对虫体可溶性抗原进行分析，免疫血清为１：３００时，仅有一条蛋白带出现强而明显的反应，其反应蛋白带的分子量为９４／９０ｋＤ。