甲基硝基亚硝基胍诱导日本血吸虫成虫培养细胞增殖条件研究

目的 运用正交试验法选择甲基硝基亚硝基胍（MNNG）诱导日本血吸虫成虫培养细胞增殖的最佳作用条件。方法 将培养第3天的日本血吸虫成虫培养细胞 正交表分别在基础培养基RPMI－1640、TC－199、DMEM／F－12含20％小牛血清附加常量抗生素的培养液（常规培养液）中用终浓度为2、3、6ug/ml的MNNG各处理24、36、48小时;随后换用常规培养液培养4周,再换用含5％小牛血清的培养液继续培养,以细胞存活时间为指标,对基础培养基、MNNG浓度及作用时间等因素进行研究。结果 日本血吸虫成虫培养细胞在基础培养基RPMI－1640含20％小牛血清附加常量抗生素的培养液中,用3ug/ml的MNNG诱导,MNNG的处理时间为48小时,诱导效果最好,培养细胞在换用5％小牛血清后可存活246天以上,并可观察到明显的细胞生长及分裂现象。结论 运用正交试验法选择出的MNNG作用条件可诱导日本血吸虫成虫培养细胞发生一定程度的转化,转化细胞的存活时间明显长于未转化细胞。     

日本血吸虫成虫培养液中氨基酸及葡萄糖含量的动态变化

目的　观察培养过程中日本血吸虫成虫细胞培养液中氨基酸 (AA)、葡萄糖 (Gluc)及甘油三酯 (TG)含量的动态变化。方法　用氨基酸自动分析仪、自动生化分析仪分别测定培养液在培养 0～ 6d过程中AA、Gluc及TG含量变化。结果　精氨酸 (Arg)、苏氨酸 (Thr)、蛋氨酸 (Met)、赖氨酸 (Lys)及Gluc含量有不同程度下降 ;天门冬氨酸 (Asp)、丙氨酸 (Ala)及游离氨 (Amm)有明显上升 ;TG变化不明显。结论　在日本血吸虫成虫细胞培养液中适当增加Arg、Thr、Met、Lys和Gluc ,同时减少Asp和Ala的含量 ,及时更换培养液有利于维持血吸虫细胞生长     

丙烯硫脲对日本血吸虫感染小鼠肝脏病变的影响

目的　观察丙烯硫脲对日本血吸虫感染小鼠肝脏病变的影响。方法　小鼠感染日本血吸虫尾蚴 2 2d后 ,隔日一次按 30 0mg/kg腹腔注射酚酶抑制剂丙烯硫脲 ,至感染后 4 2d剖杀动物 ,观察日本血吸虫感染小鼠肝脏的病理变化。结果　与感染对照组相比 ,实验组小鼠肝脏表现为散在分布的炎性细胞浸润灶 ,中心未见虫卵 ,仅见一些颗粒状物质。其平均直径和面积均较感染对照组的典型虫卵肉芽肿显著减小 (P <0 .0 1)。结论　感染小鼠腹腔注射丙烯硫脲后肝脏内未见虫卵肉芽肿的形成。     

β-巯基乙醇与肝基质对日本血吸虫培养细胞的影响

目的研究β鄄巯基乙醇与肝基质对日本血吸虫培养细胞的影响。方法将18d虫龄的日本血吸虫童虫细胞联合法接种于小盖玻片上。实验被随机分为4个组,分别为对照组、β鄄巯基乙醇组、肝基质组、β鄄巯基乙醇 肝基质联合处理组。培养第7天,对各组细胞进行核仁组织区相关嗜银蛋白(AgNORs)与乳酸脱氢酶(LDH)细胞化学染色,并结合图像分析比较4个组培养细胞的AgNORs水平及LDH活性。结果与对照组比较,肝基质组、β鄄巯基乙醇组、β鄄巯基乙醇 肝基质联合处理组培养细胞的AgNORs颗粒数目、颗粒面积与核面积百分比、平均光密度以及LDH的平均光密度等4个参数均有不同程度升高(P<0.01)。其中,以β鄄巯基乙醇组培养细胞的4个参数升高最显著,β鄄巯基乙醇 肝基质联合处理组次之,肝基质组升高幅度最小。统计学分析显示,除β鄄巯基乙醇 肝基质联合处理组与β鄄巯基乙醇组之间的AgNORs及LDH平均光密度两两比较差异无显著意义(P>0.05),其余组间3个参数两两比较差异均有显著意义(P<0.01或P<0.05)。结论β鄄巯基乙醇与肝基质均能促进日本血吸虫培养细胞的增殖、代谢,但β鄄巯基乙醇的作用比肝基质显著;二者联合使用对培养细胞的增殖无协同作用。     

Fura-2/AM荧光法测定日本血吸虫培养细胞内游离钙离子浓度

目的　研究用钙荧光探剂 (Fura- 2 / AM)检测静息状态下日本血吸虫培养细胞内的游离钙离子浓度 ([Ca2 + ]i) ,以及β-巯基乙醇对培养细胞 [Ca2 + ]i的影响。方法　将 18d虫龄的日本血吸虫童虫制成细胞悬液 ,贴壁法接种于 30 ml培养瓶中 ,培养液为 RPMI- 16 4 0含 2 0 %小牛血清及常量抗生素。在培养的 0 - 3d,制备日本血吸虫细胞悬液 ,采用 Fura- 2 / AM钙荧光探剂测定正常静息状态下及加入β-巯基乙醇后日本血吸虫培养细胞内的 [Ca2 + ]i。结果　正常静息状态下 ,培养 0 d的日本血吸虫培养细胞内的 [Ca2 + ]i为 188.2 nmol/ L ;培养 1- 3d的 [Ca2 + ]i两两比较差异无显著性(P>0 .0 5 ) ,它们的平均值为 (187.0± 10 .7) nm ol/ L ,与培养 0 d的 [Ca2 + ]i比较 ,差异也无显著性(P>0 .0 5 )。β-巯基乙醇可使日本血吸虫培养细胞内 [Ca2 + ]i明显升高 (P<0 .0 1) ,并随浓度的增加而升高。结论　培养 1- 3d,静息状态下日本血吸虫培养细胞内的 [Ca2 + ]i比较稳定 ,β-巯基乙醇能影响日本血吸虫培养细胞内的 [Ca2 + ]i     

弓形虫慢性感染小鼠脑内包囊分布的研究

目的观察弓形虫包囊在慢性感染小鼠不同脑组织内的分布情况。方法以AH株弓形虫包囊腹腔感染小鼠20只,饲养3月后取小鼠脑组织,分离出大脑皮层、海马、中脑、小脑和脑干各部分,逐一称重,用PBS液制备成脑组织匀浆(体积均为2 ml)。从每只小鼠的每种脑组织匀浆中各吸取30μl匀浆液,涂片3张,每张10μl,瑞氏染色,显微镜下(10×40)计数弓形虫包囊个数,并用方差分析比较单位浓度(mg/ml)不同脑组织的匀浆液所含包囊的个数有无显著性差异。结果单位浓度(mg/ml)不同脑组织的匀浆液所含包囊的数量有显著性差异(P<0.01),海马和大脑皮层处最多,脑干和小脑处最少。结论弓形虫包囊在慢性感染小鼠不同脑组织内的分布有显著性差异,主要集中于海马和大脑皮层处。     

肝基质与MNNG对日本血吸虫成虫培养细胞糖细胞化学作用的研究

目的研究肝基质与甲基硝基亚硝基胍(MNNG)对日本血吸虫成虫培养细胞糖类物质的影响。方法日本血吸虫成虫细胞分别接种于普通小盖玻片(实验1组)和铺敷有肝基质的小盖玻片上(随机分为实验2组和3组),培养于含20%小牛血清及常量抗生素的RPMI-1640常规培养基中。培养第4d,实验1组和3组细胞分别在含3μg/ml MNNG的常规培养基中培养48h,彻底清洗后继续用常规培养基培养;实验2组细胞用不含MNNG的常规培养基处理相同时间。培养第4w,均换用含5%小牛血清的低血清培养基培养。培养第5~7w,每周取各组细胞进行高碘酸雪夫(PAS)染色和唾液淀粉酶处理后的PAS染色,观察培养细胞内糖类物质的含量及分布变化。取培养第6w(MNNG作用后第5w)的各组染色细胞,用HPIAS-2000图像分析仪测定细胞内代表糖含量的光密度,并作统计学分析。结果实验3组细胞与实验1、2组比较,PAS染色显示的四种类型细胞其着色均显著增强,淀粉酶处理后的PAS染色显示细胞内糖原含量增多,差异均具显著性(P<0.01)。培养过程中,第二类细胞数目逐渐增多,体积增大;分裂细胞增多。这种状况在MNNG处理后第5w最为明显。结论肝基质和MNNG联合可显著增强日本血吸虫培养细胞的糖代谢和分裂增殖能力,二者具协同作用能力。     

脑型血吸虫病临床分型与CT分型的相关性研究

目的:分析脑型血吸虫病临床分型与CT分型之间的关系,探讨CT检查的临床价值。方法:回顾性分析70例脑型血吸虫病的临床及CT资料,进行临床和CT分型,分析两者之间的关系。结果:临床分型中急性脑炎型9例、癫痫型38例、脑瘤型21例、脑卒中型2例;CT分型中脑炎型17例、脑梗塞型2例、肉芽肿型44例、局限性脑软化灶和脑萎缩7例;临床急性脑炎型与CT脑炎型有相关性,其它分型间无相关性。结论:脑血吸虫病的临床表现及分型只部分反映其CT表现,其中临床急性脑炎型病人CT常表现为脑炎型,而临床其它类型表现的病人则需要通过CT来明确病灶。     

日本血吸虫酪蛋白激酶2α的表达、定位与免疫效果观察

目的:克隆、表达日本血吸虫酪蛋白激酶2α(SjCK2α)基因,并定位表达,观察其表达产物的免疫效果。方法:首先针对SjCK2α基因的开放阅读框设计特异性引物,以日本血吸虫成虫RNA逆转录后的cDNA为模板,扩增目的基因;并使其带上限制性内切酶酶切位点,获得SjCK2α的目的基因片段,回收后连入表达质粒pET28a(+)。重组质粒pET28a(+)-SjCK2α转化入BL21细胞,构建表达菌;并用IPTG诱导表达菌的表达;用Ni-NTA树脂纯化后透析,收集重组目的蛋白。用重组蛋白免疫家兔制备多克隆血清。免疫组化法对皮肤型童虫、肺型童虫和常规培养肺型童虫进行组织学定位。将重组蛋白免疫小鼠,再用日本血吸虫尾蚴攻击感染,6周后剖杀,灌注法收集日本血吸虫成虫,计算减虫率;摘取肝脏组织剪碎、KOH消化后收集虫卵,计算减卵率;摘取眼球取血,收集血清,ELISA检测细胞因子干扰素γ(IFN-γ)和白细胞介素4(IL-4)的含量。另设感染对照组和化工剂对照组进行比较分析。结果:扩增的目的基因SjCK2α基因片段长度为1047bp,构建的重组质粒pET28a(+)-SjCK2α转化入BL21细胞后,构建的表达菌在IPTG诱导下获得大量重组蛋白,纯化后免疫家兔获得多克隆血清。免疫组化染色发现,SjCK2α主要定位于童虫表面。将重组蛋白免疫小鼠后,攻击感染6周后获得15%的减虫率和17%的减卵率,与对照组的减虫率和减卵率差异无统计学意义(P0.05);此时,感染对照组的IFN-γ和IL-4含量分别为42.77±12.11和17.31±9.13,佐剂对照组的IFN-γ和IL-4的含量分别为30.99±16.55和18.65±7.52,重组蛋白免疫组的IFN-γ和IL-4的含量分别为36.19±14.56和9.90±5.20,三组间两指标比较均无统计学差异(P0.05)。结论:本实验成功克隆和表达SjCK2α基因,其主要表达于童虫表面;SjCK2α免疫小鼠后未能获得免疫性保护。     

日本血吸虫钙连蛋白(Canx)基因克隆与表达

<正>目的:钙连蛋白(Canx)在蛋白质合成中起重要作用,存在于内质网中需Ca2+的凝集素样分子伴侣蛋白,可与新合成的尚未折叠完全的蛋白质的寡糖链结合,防止蛋白质彼此聚集和泛素化,避免折叠不完全的蛋白质离开内质网;同时也可促进其它伴侣蛋白与这些蛋白质结合,使其折叠完全。无论是曼氏血吸虫还是日本血吸虫,仅有与Canx相似的钙结合蛋白的研究报道。本文报道与宿主相关的日本血吸虫Canx基因的克隆、表达,为研究其功能奠定基础。方法:提取日本血吸虫成虫总RNA,逆转录得到cDNA。设计引物用常规PCR法扩增出Canx编码基因,在设计引物时,切除了含21个氨基酸的信号肽,