通用表达型T载体的构建与真核基因的快速克隆表达

目的:为简化PCR产物真核表达载体构建步骤,构建真核表达型T载体,并对其特性及表达效率进行分析.方法:限制性内切酶EcoR V酶切真核表达载体pcDNA3,回收线性化质粒片段与dTTP 70℃退火,构成T克隆载体并回收纯化.将增强绿色荧光蛋白基因(EGFP)和中国旱獭a干扰素基因(cwIFNA5)分别扩增后直接克隆到新构建的表达型T载体,转化感受态细菌,挑选阳性菌并制备质粒瞬时转染真核细胞,荧光显微镜观察EGFP的表达,病毒保护试验检测中国旱獭a干扰素的生物学活性.结果:外源基因EGFP和cwIFNA5克隆进该载体后可以进行高效表达,基因转染72 h后,荧光显微镜观察到EGFP基因转染细胞荧光阳性率在80%以上,荧光强度高:病毒保护试验表明cwIFNA5转染细胞培养上清干扰素效价高达1∶600.结论:本研究构建的表达型T载体可用于基因的克隆之外,还可以直接用于基因的高效表达作蛋白质功能分析.     

1988年武汉地区急性出血性结膜炎的病原学研究

急性出血性结膜炎是一种潜伏期短、发病急，传染性强的传染病，近20年曾多次引起世界性大流行，现巳证实肠道病毒70型和阿萨奇A24型变异株是其主要病原。70年代初急性出血性结膜炎(AHC)巳传播到我国，曾多次在我国引起流行，但主要病原为肠道病毒70型(EV70)。l988年我国又发生大流行，我们作了病原学研究，证实为柯萨奇A24型变异株(CA24V)引起，现将结果报告如下。     

Tea polyphenols exerts anti-hepatitis B virus effects in a stably HBV-transfected cell line

In this study, the anti-HBV effects of tea polyphenols （TP） were examined. After cells were exposed to TP for 3, 6, 9 days, amounts of HBsAg, HBeAg and HBV-DNA released into the supernatant of the cultured HepG2 2.2.15 cells were detected. TP, to some extent, inhibited the secretion of HBsAg and strongly suppressed the secretion of HBeAg in a dose-dependent （P〈0.01） and time-dependent manner, with 50% maximal inhibitory concentration （IC50） value being 7.34μg/mL on the 9th day, but the time-dependence was not significant （P=0.051）. Expression of HBV-DNA in the supernatant of the cell culture also was significantly decreased in a dose-dependent fashion （P〈0.01）. The ICS0 of TP in inhibiting HBV DNA was 2.54 pg/mL. It concluded that TP possessed potential anti-HBV effects and may be used as a treatment alternative for HBV infection.     

替比夫定(素比伏)体外抑制乙型肝炎病毒复制的研究

目的观察替比夫定体外对乙型肝炎病毒（HBV）复制的抑制作用。方法HBV复制子pHBV1．3质粒转染Huh7细胞,在转染细胞培养液中加入不同浓度的替比夫定,然后在不同时间段观察替比夫定的抗病毒作用。用ELISA检测培养上清中HBsAg、HBeAg水平,用荧光定量PCR（FQ—PCR）检测培养上清中HBVDNA拷贝数,用Southern blot分析转染细胞中HBV复制中间体。结果替比夫定减少了培养上清中HBsAg、HBeAg的表达及HBVDNA拷贝数,抑制了转染细胞中HBV复制中间体的形成。替比夫定对HBV复制子体外复制的抑制作用依赖于药物浓度及作用时间。结论替比夫定在体外对HBV有较强的抑制作用。     

慢性乙型肝炎患者外周血单个核细胞α干扰素及其受体1的表达与治疗的关系

慢性乙型肝炎是长期影响人类健康的一大难题，全球约有3．5亿人血清中携带乙型肝炎病毒表面抗原。我国的感染情况严重，携带率占总人口的10％以上。目前临床治疗慢性乙型肝炎的主要方法依然是干扰素（IFN）结合核苷类药物，虽然患者对重组IFN的应答率有所增加，但还是不能令人满意。慢性乙型肝炎患者对IFN治疗出现应答差异的原因还不十分清楚。为此，我们检测了慢性乙型肝炎患者外周血单个核细胞（PBMC）诱导抗病毒IFN-α的能力，并分析α干扰素治疗前后不同应答者的α干扰素受体1（IFNAR1）的表达，试图从机体自身的免疫细胞来探讨出现差异的机制。     

化学合成siRNA体外对柯萨奇B3病毒的影响

目的RNA干扰是近年来研究基因功能的重要工具。本研究是在培养HELA细胞中，体外化学合成siRNA（small interfering RNA）对柯萨奇B3病毒（Coxsackievirus B3，CVB3）的影响，探讨RNA干扰的抗病毒效应与其应用前景。方法根据siRNA靶序列设计原则，设计了一段针对编码CVB3病毒VP4蛋白基因组的siRNA，并在体外通过化学合成形成siRNA。同时合成一段与CVB基因组序列无关的阴性对照siRNA。用CVB3感染培养HELA细胞，将其分为3组，即siRNA组（n=8），阴性siRNA组（n=8），病毒对照组（n=8），分别观察转染后第1天到第5天的细胞病变，并与未感染CVB3的空白对照组进行比较；采用RT-PCR技术检测感染CVB3各组的病毒RNA片断，观察病毒RNA与内参GAPDH的OD比值；用免疫荧光技术检测各组CVB3蛋白的表达。结果RT-PCR检测各组CVB3病毒5’端非编码区（5’UTR）RNA，siRNA组与阴性siRNA组和病毒对照组比较无明显变化（P〉0．05）；免疫荧光检测各组CVB3病毒蛋白也未见显著差异；细胞病理效应（cytophatic effects，CPE）各组问未见明显差异。结论本文选择针对编码CVB3病毒VP4蛋白基因组的siRNA未能抑制CVB3病毒复制。     

IL-1β和TNF-α在小鼠巨细胞病毒性心肌炎组织中的表达及其意义

目的研究IL-1β和TNF-α在巨细胞病毒（MCMV）心肌炎小鼠心肌组织中的表达及在心肌损伤中的作用。方法将60只4周龄BALB／C小鼠随机分为两组,实验组（36只）腹腔注射10-4TCID MCMV,对照组（24只）注射3T3细胞裂解液。观察腹腔注射后3、7、14d心肌组织中IL-1β TNF-α的表达及心肌病理改变。结果实验组心肌组织出现灶性或弥散性炎性细胞浸润、心肌细胞变性和坏死,对照组无病理改变。实验组IL-1β、TNF-α蛋自主要表达在炎性浸润细胞、变性或坏死的心肌细胞,而对照组几乎无表达。结论IL-1β、TNF-α在MCMV心肌炎心肌组织中表达,并可能在其发病中起重要作用。     

膀胱癌的Hoffman式三维组织培养

目的 应用Hoffman式组织培养技术，在体外对膀胱癌进行模拟体内环境的原代组织培养。方法 对45例膀胱癌标本进行Hoffman式组织培养，观察其体外生长特性。采用链霉素-生物素(SP)免疫组织化学技术，检测10例培养前和培养7d后的膀胱癌标本中细胞角蛋白Cytokeratin7的表达。将培养7d后的膀胱癌组织小块接种到4周龄BALB/c裸鼠腋部皮下，观察其致瘤性。结果 共有30例膀胱癌培养成功(67％)，其中G1级7／12例、G2级13／20例、G3级10／13例、T0～T1期18／31例、T2～T4期12／14例；培养成功率与膀胱癌分级、分期无关。在体外生长时间平均14d，培养前癌标本平均直径和重量分别为0．30Cm、8mg，14d后分别为0．75cm、13mg。膀胱癌组织呈3种形状生长：单细胞形式生长，细胞团块状生长，大部分维持乳头状生长；间质细胞无过度增殖。Cytokeratin7在培养前和培养7d后表达强度无明显差别。4周后有3只裸鼠在腋下成瘤。结论Hoffman式组织培养法使膀胱癌组织在体外获得类似体内的生长特点，保留其原有的三维结构和细胞间的相互作用，维持其增殖性、异源性、致瘤性等特性。     

顺序特异性引物法检测人胰腺癌细胞株PCNA-1的K-ras基因点突变的方式

胰腺癌具有发病隐匿，症状不典型，病情发展快，生物恶性程度高，预后差等特点。胰腺癌的切除率一般只在20％左右，五年生存率低于5％。本研究旨在采用顺序特异性引物法（SSP）对胰腺癌细胞株的K-ras基因点突变方式。