细胞周期蛋白E siRNA真核表达载体的构建与鉴定

目的构建细胞周期蛋白E(Cyclin E)小干扰RNA(siRNA)的真核表达载体,并检测其抑制乳腺癌细胞株MCF-7中Cyclin E表达的效果。方法根据基因文库中Cyclin E的cDNA序列,设计并合成两段siRNA,分别转入到pGENESIL-1质粒中,并对重组质粒(命名为pGENESIL/Cyclin E-1和pGENESIL/Cyclin E-2)进行测序鉴定。脂质体介导下转染MCF-7细胞株,RT-PCR检测转染后Cyclin E的表达。结果Cyclin E siRNA真核表达载体构建成功,测序结果显示插入片段的方向和序列与预想一致。RT-PCR检测显示Cyclin E的表达显著降低。结论Cyclin E siRNA真核表达载体的成功构建为进一步研究以Cyclin E为靶位点对乳腺癌进行基因治疗奠定了重要的实验基础。     

人乳腺癌细胞系MCF-7中不同亚群细胞的体内外克隆和成瘤能力分析

目的了解在人乳腺癌细胞系MCF-7中是否存在乳腺癌干细胞。方法采用流式细胞技术对MCF-7细胞进行分选,检测MCF-7中不同亚群细胞的体外克隆形成能力和体内成瘤能力。结果MCF-7中有部分细胞具有体外克隆形成能力和体内成瘤能力,而且和CD44 CD24 细胞相比,CD44 CD24-细胞中成瘤细胞的含量更高。结论MCF-7中存在乳腺癌干细胞,并主要集中于CD44 CD24-细胞中,CD44 CD24 细胞也可能是乳腺癌祖细胞。     

Wnt信号途径在不同性质乳腺组织和细胞中的表达与分布

目的 探讨乳腺癌发生发展中Wnt信号途径的改变及其关机制.方法 用基因芯片和荧光实时定量聚合酶链反应(PCR)技术检测5例乳腺癌患者不同性质乳腺组织和细胞中Wnt信号途径相关基因的表达.结果 与正常乳腺组织比较,癌组织中Frizzled 3、Lrp5、Lrp6、Wnt9a、Wnt10a表达分别上调了8.11、10.28、9.37、15.47、19.63倍(发生频率均≥60%),DDK1、DDK4、WIF1表达分别下调了10.87、9.62、12.05倍(发生频率均≥60%);其中Wnt9a、Wnt10a以及DDK1、DDK4、WIF1表达的改变主要在癌源性成纤维细胞,分别上调40.88、61.59倍和下调38.46、19.61、29.41倍(P<0.01);Frizzled 3、Lrp5、Lrp6表达改变主要在乳腺癌千细胞,分别上调了27.36、31.41、21.25倍(P<0.01).结论 在乳腺癌发生发展过程中,成纤维细胞源性因子Wntga、Wnt10a和DDK1、DDK4、WIF1的改变参与了Wnt信号途径的异常,并主要影响乳腺癌干细胞的自我更新调控.     

骨髓间充质干细胞对新生鼠高氧急性肺损伤作用的研究

目的探讨骨髓间充质干细胞(MSCs)在新生鼠高氧急性肺损伤中的作用。方法体外复苏大鼠骨髓间充质干细胞,95%氧气7d天制备新生大鼠高氧急性肺损伤模型。动物模型制备后,将40只新生大鼠随机分为实验组(经尾静脉注入含1×105MSCs的PBS)20只,对照组(经尾静脉注入等量的PBS)20只。以正常新生大鼠作为空白组20只。注入细胞后24h各组处死10只,48h各组处死10只,取肺脏切片、检测湿干重比值(W/D)及髓过氧化物酶(MPO)。结果 24h、48h实验组病理切片损伤均较对照组减轻;24h实验组W/D及MPO均低于对照组,差异有显著意义(P0.05);48h实验组W/D及MPO均明显低于对照组,差异有极显著性意义(P0.01)。结论骨髓间充质干细胞对新生鼠高氧急性肺损伤可起保护作用。     

不同阶段应用抗L3T4单抗干预治疗对心肌病小鼠细胞因子的影响

目的： 研究不同阶段应用抗L3T4单抗对心肌病小鼠Th1/Th2亚群及血清和心肌组织中细胞因子的影响，探讨抗L3T4单抗治疗自身免疫性心肌病的机制。方法: 用含有人线粒体ADP/ATP载体肽的免疫液免疫近交系BALB/c小鼠建立类扩张型心肌病模型（心肌病组）；以不含肽免疫液免疫小鼠作为对照组；在用ADP/ATP载体肽免疫小鼠的前1 d连续3 d以400 μg抗L3T4单抗免疫小鼠获得早期治疗组；心肌病组小鼠于第4个月初始连续3 d给予抗L3T4单抗治疗获得中期治疗组，单抗使用方法同早期治疗组。运用3色荧光标记流式细胞术检测小鼠脾脏中Th1/Th2的百分含量；以ELISA法检测其血清中IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-6和TNF-α水平；实时荧光定量PCR法检测其心肌细胞因子基因表达。 结果: 早期治疗组Th1及Th2亚群明显低于心肌病组；中期治疗组Th1相关细胞因子水平高于心肌病组，Th2水平介于心肌病组和早期治疗组之间。早期治疗组IFN-γ和IL-6与对照组相近，IL-2和TNF-α均高于对照组和心肌病组，IL-4介于前两组之间且与它们均有显著差异；中期治疗组IFN-γ和IL-2水平介于对照组和心肌病组之间，IL-6和IL-4明显低于心肌病组。 结论: 不同阶段应用抗L3T4单抗能够阻断或减轻系统性和局部细胞因子的生成，早期治疗较中期治疗对细胞因子的抑制作用更显著。     

端粒酶反义寡核苷酸对乳腺癌端粒酶活性及细胞生长的影响

目的　探讨端粒酶反义寡核苷酸对人乳腺癌细胞端粒酶活性的影响及抑制端粒酶活性以控制乳腺癌细胞生长的可能性。方法　采用 10 μmol/L与端粒酶催化亚基 (hTRT )mRNA互补的反义寡核苷酸处理乳腺癌细胞 ;于处理后 2 4、72h用端粒重复序列扩增及酶联免疫吸附方法检测细胞端粒酶活性 ;于处理后 72h以流式细胞术测定细胞周期 ;于处理后 12 0h采用原位末端标记法检测细胞凋亡。结果　经hTRT反义寡核苷酸作用后 ,细胞端粒酶活性明显受到抑制 ,至作用后 72h ,端粒酶活性较对照组降低 65 .6% (P <0 .0 5 ) ;细胞生长明显受到抑制 ;细胞周期发生显著变化 :G0 /G1期细胞数增多 ,S期及G2 /M期细胞数则减少 ;细胞增殖指数由 0 .46降低至 0 .2 5 ;并可观察到凋亡细胞的出现 ,凋亡发生率为 12 .5 % ;而无义组及空白对照组以上各指标均无明显变化 (P >0 .0 5 )。结论　端粒酶反义寡核苷酸可明显抑制乳腺癌细胞端粒酶活性 ,抑制细胞生长和增殖 ,诱导细胞凋亡 ;表明应用反义技术抑制端粒酶活性治疗乳腺癌具有广阔的前景。     

核素显像对实验性绞窄性肠梗阻的早期诊断

用家兔制成闭袢型、肠系膜静脉阻塞型及肠系膜动脉阻塞型的急性绞窄性肠梗阻模型，并以单纯性肠梗阻组和假手术组为对照。制模后１、４小时从兔耳静脉注射显像剂９９ｍ锝焦磷酸盐，用单光子发射计算机断层（ＳＰＥＣＴ）进行腹部平面显像的动态观察，并测定感兴趣区的摄取比值。结果显示：在闭袢型和肠系膜静脉阻塞型于注射显像剂后，绞窄肠段所在腹侧出现放射性浓聚，显像部位感兴趣区摄取比值明显大于单纯性肠梗阻组和假手术对照组；肠系膜动脉阻塞型上述改变不明显。本实验结果提示：闭袢型和静脉阻塞型绞窄缺血肠段早期有显像剂的聚集；ＳＰＥＣＴ的核素显像技术可作为早期诊断闭袢型和肠系膜静脉阻塞型肠梗阻有价值的辅助手段。     

TLR4 shRNA质粒的构建及稳定转染人胰腺癌PANC1细胞株的筛选

目的 构建靶向人TLR4基因的短发夹RNA(shRNA)真核表达质粒,转染胰腺癌细胞,并筛选出稳定转染的克隆细胞株.方法 采用小分子干扰RNA(siRNA)软件设计3个靶向TLR4基因的shRNA,构建3个质粒表达载体,分别命名为TLR4-1、TLR4-2、TLR4-3;选取抑制效率最高的shRNA质粒,采用脂质体法转染胰腺癌PANC1细胞;实时定量PCR和流式细胞技术检测细胞TLR4 shRNA基因沉默效率和转染效率;G418抗性筛选和有限稀释单克隆形成法挑选培育稳定转染TLR4 shRNA的单克隆细胞系.结果 转染48 h后PANC1细胞瞬时转染效率为(46.72±5.06)％.转染TLR4-1、TLR4-2、TLR4-3的细胞的TLR4mRNA表达水平分别为0.025±0.004、0.027±0.003、0.019±0.006,均显著低于未转染组的0.061±0.018和阴性对照转染组的0.057±0.015(P值均＜0.05).以沉默效果最佳的TLR4-3转染细胞所获得的稳转细胞的转染效率为(82.79 ±8.16)％,较瞬转细胞显著提高(P=0.001);TLR4 mRNA表达水平为0.010±0.002,较瞬转细胞显著下调(P=0.001);TLR4蛋白表达率为(0.54±0.32)％,显著低于未转染细胞的(87.42±5.00)％和转染阴性对照细胞的(82.90±5.00)％(P=0.000).结论 成功筛选到TLR4基因沉默的稳转PANC1细胞.     

基因修饰后树突状细胞吲哚胺2，3二氧化酶表达变化及其对T细胞增殖的影响

背景：研究表明，吲哚胺2，3二氧化酶的表达可以降低机体的免疫应答反应，保护细胞和组织移植物，参与同种异体移植免疫耐受。细胞毒T细胞相关抗原4可以抑制T细胞的活化，在维持周边免疫耐受的过程中起着关键性的作用，但其作用机制尚不清楚。 目的：观察转染细胞毒T细胞相关抗原4基因前后树突状细胞上吲哚胺2，3二氧化酶表达水平及其活性对T淋巴细胞增殖的影响。 设计、时间及地点：随机分组设计，对比观察，于2005-09/2007-02在华中科技大学同济医学院附属协和医院普外科实验室和眼科实验室完成。 材料：成年雌性Lewis大鼠和F344大鼠购自北京维通利华实验动物种子中心，体质量180~200 g。 方法：采用脂质体转染的方法将质粒pG/细胞毒T细胞相关抗原4转入F344大鼠髓源性树突状细胞中，将转染前、转然后24，48，72 h树突状细胞分为4组，反转录-聚合酶链反应检测转染前后骨髓源树突状细胞中吲哚胺2，3二氧化酶mRNA的表达，反相高效液相色谱法检测吲哚胺2，3二氧化酶活性。以Lewis大鼠T淋巴细胞为反应细胞，丝裂霉素C灭活的转染前后不同时间F344大鼠骨髓源树突状细胞为刺激细胞建立混合淋巴细胞培养体系。有或无L-色氨酸存在下，CCK8试剂盒检测T淋巴细胞增殖率，AnnexinV/PI双染色流式细胞仪检测T淋巴细胞凋亡。 主要观察指标：①树突状细胞吲哚胺2，3二氧化酶mRNA的表达及吲哚胺2，3二氧化酶活性。②混合淋巴细胞培养CCK8及AnnexinV-FITC细胞凋亡检测结果。 结果：转染细胞毒T细胞相关抗原4后树突状细胞中吲哚胺2，3二氧化酶的表达较转染前高(P < 0.01)，且转染后48 h树突状细胞的吲哚胺2，3二氧化酶活性最高(P < 0.01)。高表达吲哚胺2，3二氧化酶的树突状细胞在体外能诱导同种异体T细胞凋亡，抑制T细胞增殖，混合淋巴细胞培养体系中加入L-色氨酸后T淋巴细胞的凋亡率明显下降(P < 0.01)。 结论：树突状细胞上的吲哚胺2，3二氧化酶表达水平与T淋巴细胞的增殖密切相关，树突状细胞在体外可能通过吲哚胺2，3二氧化酶活性发挥免疫抑制作用。