结核病Mtb8.4基因疫苗构建、表达及诱导的细胞免疫应答

目的制备结核病Mtb8.4基因疫苗,并研究其免疫原性。方法克隆结核杆菌新抗原Mtb8.4基因,导入真核表达载体pcDNA3.1( ),构建重组质粒pcDNA3.1( )Mtb8.4,转染COS7细胞后,用RTPCR检测Mtb8.4基因在细胞内正确表达。将Mtb8.4基因疫苗肌肉注射免疫C57BL/6N小鼠,第3次DNA免疫后4周,处死小鼠,制备免疫小鼠脾细胞,脾细胞培养上清检测细胞因子水平;并按效、靶比例分别为100∶1、50∶1、10∶1进行CTL杀伤检测。结果Mtb8.4基因疫苗组免疫小鼠脾细胞培养上清中γ干扰素(IFNγ)和白细胞介素2(IL2)含量分别为787.317±45.586pg/ml和319.953±57.978pg/ml,BCG组分别为1486.540±39.600pg/ml和767.043±50.269pg/ml,BCG组IL4的含量为90.580±10.998pg/ml,明显高于其他各组(P<0.01)。效靶比为100∶1、50∶1、10∶1时,Mtb8.4基因疫苗组的CTL活性分别为55.3%、35.7%、9.2%,BCG组分别为28.9%、21.4%、9.8%。Mtb8.4基因疫苗主要使抗原特异性Th1型细胞免疫应答增强,细胞因子IFNγ和IL2分泌增加,IL4分泌减少,CTL活性增加;而BCG使IFNγ、IL2和IL4分泌均增加。结论结核病Mtb8.4基因疫苗能诱导较强的Th1型细胞免疫应答,可作为结核病的候选疫苗。     

含信号肽的结核分枝杆菌8.4/白细胞介素12嵌合基因真核表达质粒的构建、表达及免疫原性研究

目的构建和表达含信号肽的结核分枝杆菌8.4(MS)/人白细胞介素12(hIL-12)嵌合基因,并研究嵌合基因疫苗的免疫原性。方法克隆 MS/hIL12嵌合基因,导入真核表达载体 pCI-neo,构建成 MS/hIL12嵌合基因真核表达质粒,用限制性内切酶消化、聚合酶链反应(PCR)及 DNA 序列测定等多种分子生物学方法进行鉴定;重组嵌合质粒转染 COS-7细胞后,用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)和免疫印迹法(Western blot)鉴定 MS/hIL12嵌合基因的表达情况。将 MS/hIL-12嵌合基因疫苗免疫 C57BL/6N 小鼠,脾细胞培养上清检测细胞因子水平;并按效、靶比例分别为100∶1、50∶1、10∶1进行细胞毒 T 淋巴细胞(CTL)杀伤检测。结果 MS/hIL12嵌合基因重组真核表达质粒构建成功;转染 COS-7细胞后,MS/hIL12嵌合基因在转录水平成功表达。MS/hIL-12嵌合基因疫苗组免疫小鼠脾细胞培养上清中γ干扰素(IFN-γ)和白细胞介素2(IL-2)含量分别为(1 521±48)ng/L 和(755±41)ng/L,MS 基因疫苗组分别为(820±50)ng/L 和(297±31)ng/L,BCG 组分别为(1 487±40)ng/L 和(767±50)ng/L,空载体组分别为(121±16)ng/L 和(62±10)ng/L,PBS 组分别为(48±16)ng/L 和(32±17)ng/L,上述结果显示 MS/hIL-12嵌合基因疫苗组 IFN-γ、IL-2分泌量增加,明显高于 MS 基因疫苗组及对照组(P<0.01),与 BCG 组相当(P>0.05);BCG 组免疫小鼠脾细胞培养上清中白细胞介素4(IL-4)的含量为(91±11)ng/L,明显高于其他各组(P<0.01)。效靶比为100∶1、50∶1、10∶1时,MS/hIL12嵌合基因疫苗组的 CTL 活性分别为77.5%、51.2%、30.3%,MS 基因疫苗组分别为56.2%、37.8%、11.5%,BCG 组分别为28.9%、21.4%、9.8%,MS/hIL-12嵌合基因疫苗组的CTL 活性高于 MS 基因疫苗组、BCG 组、空载体组和 PBS 组(P<0.01)。结论 hIL-12与 MS 构建成嵌合基因疫苗后,MS 基因疫苗的免疫原性得到很大提高。     

健康体检管理机制的探讨与实践

<正>健康体检是指通过医学手段和方法对受检者进行身体检查,了解受检者健康状况、早期发现疾病线索和健康隐患的诊疗行为。健康体检管理是对健康体检进行流程规范、效能提升、降低成本的重要手段,因此,探索与实践健康体检管理有十分重要的意义。笔者认为采用健康检测、健康评估、医学干预管理、健康档案管理和定期随访管理可不断提高体检单位知名度、提升体检者忠诚度和信任度以及体检单位的体     

人近曲肾小管上皮细胞缺氧/复氧损伤模型的建立

目的 建立一种新的人近曲肾小管上皮细胞HK-2缺氧／复氧损伤模型。方法 本实验使用人近曲HK-2。实验分为缺氧4、12和24h及缺氧24h后复氧4、12和24h组，每个实验组均设立空白对照组。采用经高温灭菌的液体石蜡覆盖法造成缺氧环境；苔盼兰摄取法进行细胞计数及检测细胞存活率，生化法检测培养基中的乳酸脱氢酶（LDH）含量。结果 人肾小管上皮细胞经过缺氧／复氧处理后，苔盼兰摄取率显著提高，细胞存活率显著下降，LDH含量升高。说明缺血-再灌注损伤导致了细胞膜的完整性破坏，甚至细胞发生了不可逆转的损伤。结论 采用液体石蜡覆盖法建立人近曲肾小管上皮细胞缺氧／复氧损伤模型，较其他制模方法操作简单、易行、可靠。     

白细胞介素1β诱导肾小管上皮细胞的转分化

目的:观察白细胞介素1β对肾小管上皮细胞-肌成纤维细胞转分化及细胞分泌功能的影响。方法:实验于2005-06/2006-01在泸州医学院附属医院传染免疫研究室完成。以体外培养的正常大鼠肾小管上皮细胞(NRK52E)为研究对象,给予白细胞介素1β(10μg/L)刺激,12,24,48,72h后在倒置相差显微镜下观察细胞形态变化;免疫双标法检测α-平滑肌肌动蛋白和E-钙粘连素的表达;ELISA法测定培养细胞分泌的纤维连接蛋白含量。结果:白细胞介素1β刺激48h后肾小管上皮细胞转变为明显类似成纤维细胞形态;刺激12h即可见α-平滑肌肌动蛋白的表达由64.80±2.19增加到83.23±2.71(P<0.05),E-钙粘连素的表达由81.77±1.27减少到64.50±1.31(P<0.05),随刺激时间延长上述变化越明显,72hα-平滑肌肌动蛋白表达增加到170.53±3.94;E-钙粘连素表达减少到26.20±2.32。细胞培养上清液中纤维连接蛋白含量随时间延长增加(P<0.05),白细胞介素1β刺激72h时纤维连接蛋白增加1倍。结论:白细胞介素1β可诱导肾小管上皮细胞-肌成纤维细胞转分化,增加纤维连接蛋白的分泌。     

血管紧张素-（1-7）对转化生长因子-β1诱导系膜细胞增殖及细胞外基质分泌的影响

目的探讨血管紧张素-（1-7）[Ang-（1-7）]对转化生长因子-β1（TGF-β1）诱导大鼠系膜细胞（GMC）增殖和细胞外基质分泌的影响。方法选择对数生长期GMC,分为对照组、Ang-（1-7）组、TGF-β1组、TGF-β1＋Ang-（1-7）组,采用WST-1检测系膜细胞增殖,RT-PCR法和放射免疫法检测细胞外基质层粘蛋白（LN）、Ⅳ型胶原（COLIV）的表达。结果与对照组相比,Ang-（1-7）组细胞数目和细胞外基质减少（P〈0．05）;与TGF-β1组相比,Ang-（1-7）可抑制TGF-β1诱导的系膜细胞增殖、使细胞内LNmR-NA、COLⅣ mRNA表达量明显下调、同时导致上清液中细胞外基质LN、COLⅣ含量显著减少（P〈0．05）。结论Ang-（1-7）能抑制基础和TGF-β1诱导的GMC细胞增殖及细胞外基质的分泌,可能在抑制肾脏纤维化过程中发挥作用。     

ERK1/2信号通路在Ang-(1-7)抑制AngⅡ诱导的NRK52E转分化中的作用

目的探讨血管紧张素-(1-7)[Ang-(1-7)]对血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)诱导的大鼠肾小管上皮细胞(NRK52E)表型转化及ERK1/2信号分子在转分化过程中的作用。方法体外培养NRK52E,经Ang-(1-7)和AngⅡ(终浓度均为10-6mol/L)干预24、48、72、96 h后,应用细胞免疫化学法检测E-cadherin、α-SMA的表达;干预72、96 h后,应用Western blot法检测P-ERK1/2表达水平的变化。结果 AngⅡ作用96 h后,E-cadherin的表达显著减弱(P<0.05),α-SMA的表达显著增强(P<0.05),P-ERK1/2表达显著增强(P<0.05);同时加入Ang-(1-7)后,与AngⅡ组比较,E-cadherin的表达显著增强(P<0.05),α-SMA的表达显著减弱(P<0.05),P-ERK1/2表达显著减弱(P<0.05)。结论 Ang-(1-7)能够抑制AngⅡ诱导的大鼠NRK52E表型转化,ERK1/2信号通路参与了肾小管上皮细胞转分化过程。     

参麦对缺血再灌注鼠肾小管细胞损伤的作用

目的 :观察参麦注射液对缺血再灌注性鼠肾小管细胞损伤的作用。方法 :用传代培养的肾小管细胞复制缺血再灌注模型 ,MTT法测定细胞增殖活性 ,酶组化法测定细胞膜和线粒体中ATP酶和LDH含量的变化 ,用生化法检测小管细胞内SOD活性和MDA含量 ,观察参麦注射液 (SMI)对培养的鼠肾小管细胞的增殖和对缺血再灌注性小管细胞损伤的作用。结果 :不同浓度的SMI对肾小管细胞有明显的促增殖作用 ,在SMI浓度为 5 0 μg .ml- 1 时 ,促增殖作用最强 ;SMI能显著提高IR后小管细胞的增殖活性和增加细胞的存活率。缺血培养 4小时后 ,MDA含量明显增高 ,ATP酶、LDH含量明显降低 ,SMI降低IR培养的小管细胞MDA含量 ,增强SOD活性 ,ATP酶、LDH含量。结论 :本实验提示SMI具有促进鼠肾小管细胞增殖和减轻肾小管细胞IR损伤的作用 ,其机制可能与增强SOD的活性、加速OFR的清除 ,增强细胞抗氧化的能力 ,减轻膜的脂质过氧化 ,抑制ATP酶含量减少 ,进而持续生物膜的结构和功能的完整性有关。     

悬浮液进样—火焰原子吸收光谱法测定中草药中的微量锰

目的：将悬浮液进样技术应用于火焰原子吸收光谱法,建立用原子吸收法测定中草药中微量元素的快速分析新方法。方法：将样品粉碎、悬浮在琼脂胶体中制成悬浮液,取适量样品悬浮液配制成试液,在试液中加入钙盐溶液以消除化学干扰。将试液喷入空气－乙炔火焰中,以空白溶液为参比,用标准加入法测定。结果：已用本方法成功地测定了当归、川芎及川乌中的锰,测定结果与灰化法－火焰原子吸收法一致,相对误差小于±２０％,ｔ检验表明２种方法之间无显著性差异。方法简便、快速、准确。结论：用悬浮液进样法取代灰化法进行样品前处理,以火焰原子吸收光谱法测定中草药中的锰是可行的。