TLR4基因RNA干扰载体的构建及其抑制效率比较

目的 构建含有Toll样受体4(TLR4)基因特异性RNA干扰序列的pSliencer4.1-CMV neo载体,比较其对TLR4的抑制效率.方法 通过Ambion公司的在线软件设计TLR4基因(GenBank:NM138554)的RNA干扰(RNAi)序列,按siRNA设计的优化原则筛选靶序列,再选取其中部分序列进行合成,经退火、连接,构建含有TLR4基因特异性RNA干扰序列的pSliencer4.1-CMVneo载体.用脂质体SPort XP-1分别将载体及阳性和阴性对照质粒转染血管内皮细胞系EVC-304细胞,提取细胞总RNA,进行RT-PCR反应,筛选抑制效率较高的载体.结果 共设计出可供选择的序列228条,经BLAST比对后,有30条序列有较好的序列特异性,并根据其在基因中的相对位置选择9条作为siRNA靶序列.RT-PCR结果表明其中有5个载体具有较高的抑制效率,以TS4,TS6,TS8抑制效率最高,分别为89%,90%,88%,其余siRNA的抑制效率均未超过50%.抑制效果较好的5条序列在TLR4基因中的位置分别为444、1 203、1 389、2 774、3 409nt处.结论 成功构建了抑制效率较高的TLR4基因特异性RNA干扰序列的pSliencer4.1-CMV neo载体,筛选出特异性抑制TLR4表达的序列,为TLR4信号转导的研究奠定了基础.     

细胞因子/趋化因子在汉坦病毒感染发病机制中的作用

汉坦病毒感染存在错综复杂的免疫应答。病毒入侵后,不仅诱导体液和细胞免疫应答,而且引起 细胞因子/趋化因子的释放。这些因子在汉坦病毒相关疾病发病机制中的作用正日益受到重视,取得了重要进展。     

丙型肝炎病毒感染的不同人群HCV RNA定量研究

目的　了解丙型肝炎病毒感染的不同人群血清 HCV RNA水平 ,比较定性和定量 PCR结果 ,探讨 HCV含量与血清 AL T的相关性 .方法　采用荧光定量 PCR和逆转录巢式定性 PCR同时检测 136例丙型肝炎病毒感染者血清 HCV RNA,并测定定量 PCR (+ )者血清 AL T.用相关系数分析 HCV RNA含量与血清 AL T的关系 .结果　定性 PCR阳性率为 80 .88% ,定量 PCR阳性率为 77.94% .两者相对符合率为 94.12 % .定量 PCR(+ )血清 (10 6例 ) HCV RNA含量在 10 7.0 4～ 10 1 0 .96拷贝· L- 1 .无症状献血员 HCV RNA含量显著低于慢性丙型肝…     

Toll样受体介导的抗病毒天然免疫

病毒能否在细胞内生存和复制取决于宿主的抗病毒机制.天然免疫(Innate immunity)作为机体抗感染免疫的第一道防线,主要在获得性免疫(Adaptive immunity)活化前,发挥抗感染作用.     

定量PCR检测血清中乙型肝炎病毒DNA及其意义

目的检测血清中乙型肝炎病毒DNA拷贝数,并了解HBV感染的不同血清学指标组合相应的HBV DNA含量分布,以指导临床。方法 采用定量PCR和定性PCR方法,检测216份不同临床类型血清标本的HBV DNA,再用ELISA方法测定HBV-M,统计不同免疫指标组合的HBV DNA平均含量。结果病毒量分为高、中、低三度,大于107拷贝mL-1为高滴度:107-105拷贝mL-1为中等滴度;105拷贝mL-1以下为低滴度。60例HBsAg(+)HBeAg(+)HBcAb(+)血清,HBV DNA全部阳性,平均含量为1.9×108拷贝mL-1。51例HBsAg(+)HBeAb(+)HBcAb(+)血清,HBV DNA平均含量为5.4×106拷贝mL-1;33例HBsAg(+)HBeAb(+)血清,HBV DNA平均含量为7.5×105拷贝mL-1;114例HBsAb(+)HBeAb(+)HBeAb(+)血清,HBV DNA平均含量为1.8×105拷贝mL-1。定性和定量PCR阳生率分别为59.3％和61.6％。两种方法相对符合率为94.5％。结论定量PCR可真实反应HBV感染、复制及病程变化,对乙型肝炎临床诊断及治疗均有较大的指导意义。     

HIV-1辅受体的配体细胞内双表达对病毒感染的阻断作用

目的　观察Ⅰ型人免疫缺陷病毒 (HIV 1)辅受体的配体———RANTES和SDF 1α双表达于人淋巴细胞对各种嗜性HIV 1毒株感染的阻断作用。方法　用 pLNCX R K S K重组逆转录病毒液感染原代人外周血淋巴细胞 (PBLs) ,抗神经生长因子受体 (NGFR) 免疫磁珠法分离转化成功的PBLs,流式细胞仪检测筛选效率 ;HIV 1M嗜性、T嗜性和双嗜性毒株攻击转化PBLs ,检测HIV 1逆转录酶活性和 p2 4抗原分泌 ,以观察抗HIV 1感染的作用 ;同时进行转化PBLs表面CD3、CD4、CCR2、CCR5和CXCR4表达及破伤风毒素刺激后3 H 胸苷 (thymidine)掺入量检测 ,观察HIV 1辅受体配体的双表达对人PBLs正常生物学功能的影响。结果　抗 NGFR 免疫磁珠法获得了转化成功的PBLs,流式细胞仪检测发现pLNCX R K S K转染组 92 %以上的PBLs鼠抗NGFR标记物为阳性 ;HIV 1M嗜性、T嗜性和双嗜性毒株攻击后 ,pLNCX R K S K转化PBLs可以见到明显的逆转录酶活性和 p2 4抗原分泌抑制 ,并且在感染后第 12～ 2 0天时抑制作用最强 ;pLNCX R K S K转化PBLs表面CD3、CD4和CCR2表达水平无明显变化 ,而CCR5和CXCR4表达水平降低 ;破伤风毒素刺激后的转化PBLs仍具有主动增殖的能力。结论　HIV 1辅受体的配体通过在人PBLs内双表达 ,使HIV 1两类主要辅受体表型剔除 ,基本阻断了     

肾综合征出血热患者永生化B淋巴母细胞系的建立

目的 建立肾综合征出血热患者永生化的B淋巴母细胞系，为进一步研究汉滩病毒感染者的细胞免疫功能奠定基础。方法 自HFRS患者血液中分离外周血单个核细胞(PBMC)，再用EB病毒感染PBMC，同时加入环胞素A(CysA)。结果 20例血样标本经EBV感染4周左右，形成了15例永生化B淋巴母细胞系。成功转化后的B淋巴母细胞系，其体积增大，进而增殖的淋巴细胞积聚成团。结论 永生化的B淋巴母细胞系可传代培养。冻存复苏后细胞增殖活性并无改变。     

094 EBV转化的B淋巴母细胞系的建立及应用

EBV转化B淋巴细胞后,形成永生化的B淋巴母细胞系(B-LCL).B-LCL在体外能无限增殖,广泛应用于医学生物学研究领域.本文就EBV对B淋巴细胞的转化机制、建立B-LCL应注意的问题以及B-LCL在细胞与分子遗传学、免疫学、EBV相关肿瘤的免疫治疗等方面的进展作一简要综述.     

TLR4介导汉滩病毒引起血管内皮细胞分泌IL-6和TNF-α

目的检测汉滩病毒感染血管内皮细胞后IL-6,IL-8和TNF-α的分泌变化及其与TLR4的关系。方法用5LgTCID50/mL的HTNV76-1180.2mL感染EVC-304细胞(TLR4+)和EVC-304TS4(TLR4-)分别为实验组,以病毒未感染为阴性对照组,以LPS(2μg/mL)刺激作为阳性对照。48h后取细胞培养上清,用人IL-6,IL-8和TNF-α定量EIA试剂盒分别检测IL-6,IL-8和TNF-α在两个细胞系感染前后的分泌水平。结果IL-8在两个细胞系中感染前后的变化不明显,IL-6和TNF-α在EVC-304细胞系中,HTNV感染后升高,而在TLR4表达阴性的EVC-304细胞中,感染前后变化不明显。结论在TLR4表达阳性的EVC-304细胞中IL-6和TNF-α分泌增加,血管内皮细胞EVC-304在HTNV感染后的IL-6和TNF-α分泌可能是TLR4介导的。     

连续性肾脏替代治疗与间断性血液透析在重症肾综合征出血热治疗中的应用

目的回顾性观察连续性肾脏替代治疗(continuous renal replacement therapy,CRRT)与间断性血液透析(intermittent hemodialysis,IHD)在重症肾综合征出血热(hemorrhagic fever with renal syndrome,HFRS)患者中的应用。方法依据临床分型标准,将2008年1月—2012年8月在我中心行血液净化治疗的147例重症HFRS患者分为重型组和危重型组;参照中华医学会ICU血液净化指南,对纳入患者行CRRT或IHD治疗,比较2组行CRRT或IHD治疗的病死率、并发症发生率和急性期的实验室指标。结果重型组患者均存活;危重型组患者行CRRT与IHD后的病死率比较差异无统计学意义(P=0.124);危重型组行CRRT的比例明显高于重型组(P0.001)。病程中存在重叠期的重症患者,行CRRT初始治疗的例数明显多于行IHD的例数,但其生存率比较差异无统计学意义(P=1.000)。CRRT组患者病情较IHD组重,其疾病本身的肾外并发症也较IHD组常见。结论 CRRT可广泛应用于危重型HFRS患者的救治。CRRT可有效减轻水负荷,稳定机体的血流动力学状态,将有助于使危重患者平稳地渡过急性期。