消化系肿瘤增殖诱导配体高表达细胞株的筛选

目的 筛选出增殖诱导配体(APRIL)mRNA高水平表达的人消化系肿瘤细胞株,为进一步探讨APRIL基因在消化系统肿瘤发生、发展以及转移过程中的作用机制奠定基础.方法 选择2株人胃癌细胞(AGS、SGC7901)和3株人胰腺癌细胞(PANC1、CFPAC-1、BxPC3)培养提取mRNA后,逆转录成cDNA作PCR模板.以APRIL基因高保守区设计特异性的引物,以磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)为内参,PCR扩增目的片段,通过计算机图像扫描系统分析各株细胞的APRIL mRNA的表达量,以表达量最高的1株作为1,获得各细胞株的APRIL mRNA表达量的相对值.结果 5株细胞APRIL mRNA的相对值分别为:AGS,0.09;SGC 7901,0.61;PANC 1,0.45;CFPAC 1,1;BxPC3,0.57,按表达量高低顺序为:CFPAC 1 ＞ SGC 7901 ＞ BxPC3 ＞ PANC 1 ＞ AGS.结论 在不同肿瘤细胞中APRIL的表达有高有低,提示APRIL基因在肿瘤发生、发展过程中起一定作用.     

鸟苷酰环化酶C质粒标准品的构建

目的:制备人鸟苷酰环化酶C(GC-C)质粒标准品,为实时荧光定量PCR检测GC-C含量,探讨大肠癌患者外周血单个核细胞(PBMC)GC-C mRNA表达水平及临床意义奠定基础。方法:在鸟苷酰环化酶C(GC-C)基因高保守区设计特异性的引物和探针,RT-PCR扩增目的片段并连接于pGEM-T载体,以得到GC-C质粒标准品。结果:经过蓝白斑筛选,PCR或EcoR I酶切初步鉴定,阳性克隆测序分析确定GC-C质粒标准品正确性。结论:正确构建GC-C质粒标准品为RFQ-PCR标准曲线的绘制及GC-C的定量检测奠定了基础。     

靶向胰腺癌细胞株增殖诱导配体基因小干扰RNA的制备及纯化

目的:制备及纯化针对增殖诱导配体基因(APRIL)的小干扰RNA(APRIL siRNA),为进一步研究APRIL基因在人胰腺癌中的作用奠定基础.方法:构建靶向胰腺癌CFPAC-1细胞株APRIL基因双链RNA(APRIL dsRNA)的表达质粒pET-22b-APRIL, 在大肠杆菌中发酵表达APRIL dsRNA,并利用CF-11树脂亲和层析纯化;用大肠杆菌Ⅲ型RNA水解酶(RNase Ⅲ)水解dsRNA,制备APRIL siRNA,应用DEAE树脂离子交换层析使RNaseⅢ与核苷酸分离,分子筛层析进一步分离纯化APRIL siRNA.将纯化后的APRIL siRNA转染CHO细胞,荧光显微镜下观察转染后CHO细胞APRIL蛋白的表达情况.结果:pET-22b-APRIL转染大肠杆菌后,经IPTG诱导能大量表达APRIL dsRNA,表达产物经CF-11树脂纯化能得到纯化的APRIL dsRNA;dsRNA经RNase Ⅲ水解后,过DEAE树脂离子交换层析柱,经5%PAGE、12%SDS-PAGE电泳证实RNase Ⅲ与核苷酸分离,进一步经分子筛层析分离纯化,得到纯化APRIL siRNA.荧光显微镜下观察结果表明,APRIL siRNA转染CHO细胞能明显抑制APRIL蛋白的表达.结论:成功制备了靶向CFPAC-1细胞株的APRIL siRNA,为下一步敲减CFPAC-1细胞APRIL基因的研究奠定了基础.     

RNA干扰技术在胰腺癌基因治疗中的应用

RNA干扰(RNAi)是双链RNA(dsRNA)介导的、由特异性引起的转录后基因沉默现象. RNA干扰技术作为基因沉默的有效手段,在肿瘤治疗方面显示出良好的前景.现就RNA干扰的机制、双链RNA的设计、小干扰RNA(siRNA)的制备方法和RNA干扰技术在胰腺癌治疗研究中的应用进展作一综述.     

儿童共济失调鉴别诊断研究进展

儿童共济失调鉴别诊断范围广泛,临床易误诊、漏诊,其病因与病程相关,本文将根据病程的不同来分别阐述儿童共济失调常见的病因及其研究进展.     

胃黏膜癌变过程中增殖诱导配体及其受体表达水平分析

目的 分析胃癌发生各阶段组织中增殖诱导配体（APRIL）及其受体mRNA的表达水平。方法 在APRIL及其受体基因的高保守区设计相应引物和荧光探针，实时检测PCR产物的荧光强度，根据标准品建立标准曲线，由软件自动计算出待测样本中靶基因mRNA的准确含量，并以靶基因和内参β2微球蛋白（β2M）mRNA含量比值作为评价靶基因表达水平的指标。结果 采用实时荧光定量PCR（RFQ-PCR）检测靶基因mRNA含量的线性范围为10^1～10^9pg／ml，批内和批间重复性测定的变异系数（d）分别为6．52％～12．02％和8．76％～14．16％。APRIL在肠上皮化生、异型增生和胃癌组织中的表达水平显著高于正常胃黏膜（P〈0．05）．在胃癌组织中的表达水平又显著高于肠上皮化生和异型增生（P〈0．05），而其受体B细胞成熟抗原（BCMA）和穿膜蛋白活化物（TACI）在各种胃黏膜病变之间表达水平差异无统计学意义（P〉0．05）。结论 RFQ-PCR检测APRIL及其受体mRNA含量，具有较好的灵敏度和重复性。APRIL在胃癌病变演进过程中呈现累积和渐进趋势，可能在胃癌发生、发展过程中起重要作用．有可能成为胃癌早期诊断和抗癌治疗的靶分子。肿瘤组织可能还表达APRIL未知受体。     

实时荧光定量PCR检测鸟苷酰环化酶C基因表达方法的建立

目的建立实时荧光定量PCR(RFQ-PCR)检测鸟苷酰环化酶C(GC-C)基因表达的方法。方法在GC-C基因高保守区设计了特异性的引物和探针,RT-PCR扩增目的片段并实时检测产物的荧光强度,根据标准品建立标准曲线,由软件自动计算出待测样本中GC-C mRNA含量,并以GC-C mRNA和β2M mRNA含量的比值作为评价GC-C表达水平的指标。结果本法检测GC-C mRNA含量的线性范围为101pg／ml-109pg／ml,样本批内和批间CV值分别为6．87％一11．12％和8．86％- 15．19％。30例健康献血员和11例大肠良性病变患者的外周血单个核细胞(PBMC)中均未检出GC-C mRNA表达,大肠癌患者PBMC的GC-C mRNA检出率为83．8％(31／37),表达水平为0．88±0．06。10例大肠癌组织和T84细胞株均检出GC-C mRNA,表达水平分别为每μg组织(0．86±0．07)和每个细胞0．0082。结论成功建立RFQ-PCR检测GC-C mRNA含量的方法,具有较好的检测灵敏度、特异性和可重复性。     

人胃腺癌细胞株AGS、SGC-7901增殖诱导配体mRNA的表达

目的:比较人AGS、SGC-7901两种胃癌细胞株中增殖诱导配体(APRIL)mRNA的表达水平。方法:通过半定量RT-PCR检测APRIL mRNA,筛选出APRIL mRNA高表达细胞株。结果:以GAPDH为内参,通过计算机图像扫描系统分析各株细胞APRIL mRNA的表达量,获得人胃腺癌细胞株APRIL mRNA表达量的相对值,AGS0.09,SGC-79010.61。结论:SGC-7901为APRIL mRNA高表达细胞株。