腺病毒介导的白介素-24转移对脂多糖诱导的大鼠肾小球系膜细胞凋亡和周期调节蛋白p21、p27及CyclinE的影响

目的 探讨腺病毒介导的IL-24转移对脂多糖（LPS）诱导的大鼠肾小球系膜细胞（GMCs）和细胞周期调节蛋白p21、p27及CyclinE的影响。方法 采用10%FBS/DMEM培养293细胞,扩增腺病毒载体, GMCs培养4~6代细胞后用于分析。①观察IL-24对LPS诱导的GMCs凋亡影响：分为对照组、Ad.IL-24组、LPS组和LPS+ Ad.IL-24组,其中对照组和LPS组GMCs不转染携带IL-24腺病毒（Ad.IL-24）,Ad.IL-24组和LPS+Ad.IL-24组以Ad.IL-24转染GMCs,LPS组和LPS+Ad.IL-24组加LPS培养,以流式细胞术检测培养后24和48 h的GMCs凋亡率;②考察IL-24对GMCs周期蛋白影响：对照组为5%FBS/DMEM培养GMCs,Ad-GFP组采用携带绿色荧光蛋白的对照载体（Ad.GFP）转染GMCs,Ad.IL-24+LPS组以Ad.IL-24转染GMCs,采用Western-blot检测p21、p27及CyclinE表达。结果 ①GMCs在培养后24和48 h细胞凋亡率：对照组分别为(0.86±0.15)%和(0.98±0.4)%;IL-24组分别为(1.02±0.22)%和(1.43±0.31)%;LPS组分别为(2.19±0.81)%和(2.49±0.12)%,LPS+Ad.IL-24组分别为(18.01±1.17)%、(26.82±5.01)%;2个观察时间点细胞凋亡率对照组与IL-24组差异无统计学意义, LPS组显著高于对照组（P＜0.05）,LPS+ Ad.IL-24组细胞凋亡率最高（P＜0.05）。②Ad-GFP组p21、p27表达显著低于对照组（P<0.05）,CyclinE表达显著高于对照组（P<0.05）;Ad.IL-24+LPS组p21、p27表达较Ad-GFP组显著上调（P<0.05）,CyclinE表达较Ad-GFP组下调。结论 IL-24腺病毒载体对正常GMCs无影响,但可使LPS诱导增生的GMCs凋亡增加,其可能机制是上调关键细胞周期负调控蛋白p21、p27及下调CyclinE。     

携带mda-7基因的复制缺陷型腺病毒通过促进线粒体释放促凋亡蛋白杀伤肝癌细胞

目的 探讨黑色素瘤分化相关基因7/白介素24(mda-7/IL-24)基因选择性杀伤肝癌细胞的机制.方法 应用携带mda-7基因的复制缺陷型腺病毒Ad.mda-7感染正常肝细胞L02和肝癌细胞HepG2.通过逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)、酶联免疫吸附实验(ELISA)及Western blot方法,观察mda-7/IL-24基因的表达;应用Hoeehst染色和流式细胞仪观察mda-7/IL-24对肝癌细胞的杀伤作用;采用RT-PCR和Western blot方法,观察Bcl-2家族和caspase-9基因表达的变化,分离不同感染时点细胞内线粒体和胞浆蛋白,并检测线粒体释放促凋亡蛋白细胞色素C(Cyt-C)和Smac/DIABLO的变化过程.结果 Ad.mda-7能介导mda-7/IL-24在两种细胞株中的高效表达.能选择性杀伤肝癌细胞,感染24 h后,HepG2细胞凋亡率为24.0%±4.6%,而对正常的肝细胞没有影响.RT-PCR和亚细胞蛋白的分析结果显示,胞浆内Bel-2和Bcl-xL的表达在HepG2细胞中明显下降,而在L02细胞中的表达无变化,Bax在肝癌细胞中的表达明显增强,Bak的表达无变化;Ad.mda-7能促进细胞线粒体释放cyt-C和Smac/DIABLO蛋白,并促进caspase-9的表达.结论 Ad.mda-7能选择性杀伤肝癌细胞HepG2,通过促进线粒体促凋亡蛋白的释放而诱导肝癌细胞凋亡.     

结缔组织生长因子在血吸虫病肝纤维化肝窦毛细血管化形成中的作用

目的通过动态观察结缔组织生长因子(connective tissue growth factor,CTGF)在血吸虫病性肝纤维化鼠肝窦内皮细胞表达水平的时相变化,探讨CTGF、肝窦内皮细胞与肝窦内皮下基底膜形成的关系。方法采用腹部敷贴法感染血吸虫尾蚴建立血吸虫病性肝纤维化模型,模型组和正常对照组均为40只。于45、60、90、120 d取肝组织标本,苏木素-伊红(HE)、Masson染色和透射电镜观察模型病理变化;免疫组织化学技术检测CTGF、ColⅣ和LN在小鼠肝脏组织中的定位、发布,并应用彩色图像分析仪进行半定量分析;Western blot检测CTGF蛋白;逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测CTGF mRNA的表达。结果血吸虫病肝纤维化鼠肝窦内皮细胞表达CTGF蛋白阳性或强阳性,肝窦壁LN、ColⅣ表达水平增高,且随着肝纤维化的发展,CTGF和LN、ColⅣ表达逐渐增强,同步可见肝窦内皮下基底膜逐渐增厚;正常对照组呈阴性或低水平表达。图像定量分析两组平均吸光度值、平均灰度值和阳性面积比具有统计学意义(P<0.05)。相关分析CTGF蛋白与LN、ColⅣ水平呈正相关(r=0.7512、0.6417,P<0.01)。结论血吸虫病肝纤维化时小鼠肝窦内皮细胞调控细胞外基质产生,通过CTGF蛋白表达上调,导致ColⅣ、LN分泌增加,参与肝窦内皮下基底膜形成,从而引起肝内微循环障碍。     

β-连环素在肝癌中的表达及其与cyclin D1表达的关系

目的:探讨β-连环素(β-catenin)在肝癌中的表达及其对cyclinD1表达的影响.方法:采用免疫组织化学SP染色法检测38例肝细胞癌,8例肝硬化以及5例正常肝组织中β-catenin和cyclinD1蛋白的表达水平.结果:β-catenin在正常肝组织和肝硬化组织中呈微弱的膜表达.55.2%(21/38)的肝细胞癌组织β-catenin呈异常表达,异常表达的β-catenin主要位于癌细胞胞质.低分化、有转移的肝癌其β-catenin异常表达率明显高于高分化、无转移的肝癌.β-catenin异常表达与cyclinD1过表达显著相关(P=0.017).38例肝癌中13例(34%)显示β-catenin异常表达伴cyclinD1阳性染色,15例(39%)显示β-catenin正常表达伴cyclinD1阴性染色.结论:β-catenin的异常表达与肝癌的进展和转移有关.其机制可能是通过激活cyclinD1基因的表达,促使肝细胞增殖和恶性转化而实现.     

腺病毒介导MDA-7/IL-24选择性促进肝癌细胞的凋亡和增殖阻滞

目的 观察MDA-7／IL-24基因对不同p53状态人肝癌细胞HepG2、MHCC97L以及Hep3B和正常的肝细胞L02的选择性杀伤作用，为肝癌的基因治疗提供理论基础。方法 将携带人MDA-7／IL-24基因的腺病毒Ad．mda-7感染人正常肝细胞L02和不同p53状态的肝癌细胞HepG2，MHCC97L、Hep3B。通过逆转录聚合酶链反应方法观察MDA7／IL24基因的表达，酶联免疫吸附法检测细胞培养上清液中MDA-7／IL-24蛋白的浓度，通过四甲基偶氮唑盐染色法及Hoechst染色观察MDA-7／IL-24对肝癌细胞的生长抑制和杀伤作用，Annexin-V和碘化丙啶双染后流式细胞仪检测细胞的凋亡，应用流式细胞仪检测细胞周期。结果 复制缺陷型腺病毒能介导外源基因MDA-7／IL-24在肝癌细胞株HepG2，MHCC97L和Hep3B以及正常细胞L02中高效表达。细胞培养上清液中有MDA-7／IL-24蛋白表达。MDA-7／IL-24能明显抑制各种肝癌细胞的生长，Hoechst染色提示MDA-7／IL-24促进肝癌细胞的凋亡，流式细胞仪提示MDA-7能选择性杀伤肝癌细胞而对正常的肝细胞无影响，细胞周期分析提示MDA-7／IL-24阻滞肝癌细胞在G2／M期，同时对正常的肝细胞没有促凋亡作用和增殖阻滞作用。结论 复制缺陷型重组腺病毒载体Ad．mda-7能介导MDA-7／IL-24基因在人肝癌细胞中高效表达，选择性地杀伤肝癌细胞HepG2、MHCC97L和Hep3B，促进细胞增殖阻滞及诱导肿瘤细胞凋亡而与肿瘤细胞的P53基因的状态无关，同时对正常的肝细胞L02无任何毒性作用。     

腹腔镜胆囊切除术联合术中ERCP治疗胆囊结石合并胆总管结石的Meta分析

目的本研究是对英文前瞻性随机对照研究(RCT)的一项Meta分析,比较一站式LC联合术中经内镜逆行性胰胆管造影术(ERCP)和二站式LC联合术前ERCP方法治疗胆囊结石合并胆总管结石的安全性和有效性。方法检索2017年7月(包含7月)PubMed、Embase和Cochrane Library数据库,采用了符合数据纳入标准的前瞻性随机对照试验。使用RevMan 5.3计算各项指标的95%可信区间(CI)的比值比(OR)。比较两种手术方式在胆总管结石清除率、住院时间、ERCP插管成功率、ERCP后胰腺炎发生率、是否需再次手术、死亡率方面的差异。结果共纳入6项RCT研究共715例,其中一站式355例,二站式360例。两组胆管结石清除率(OR:1.80;95%CI:0.76,4.22)相似。与二站式ERCP联合术前LC组比较,一站式LC联合术中ERCP组住院时间显著缩短(4.6 d比6.9 d),ERCP插管成功率(OR:2.50;95%CI:1.18,5.31)较高,ERCP后胰腺炎发生率(OR:0.16;95%CI:0.05,0.51)较低,再次手术治疗率(OR:0.29;95%CI:0.16,0.55)较低,死亡率方面两组治疗方法差异无统计学意义(OR:3.06;95%CI:0.12,76.95)。结论一站式LC联合术中ERCP治疗胆囊结石合并胆总管结石是安全有效的。并且在缩短住院时间、提高ERCP插管成功率、降低ERCP后胰腺炎发生率和再次手术率方面表现更优。     

携带mda-7基因的复制缺陷性腺病毒联合阿霉素致肝癌细胞HepG2凋亡机制的研究

目的 探讨黑色素瘤分化相关基因-7/白介素-24(MDA-7/IL-24)基因联合阿霉素杀伤肝癌细胞HepG2,并逆转HepG2多药耐药的机制.方法 以人肝癌细胞系HepG2为实验对象,使用MTT法和流式细胞仪比较Ad.mda-7联合阿霉素处理组与阿霉素组、Ad.mda-7组对肝癌细胞HepG2的作用差异.阐明MDA-7/IL-24对多药耐药的逆转作用的机制.实时定量PCR检测MDR-1、STAT-3、BCL-2、BAXmRNA的变化.Western blot检测gp-170、stat3、P-stat-3、PKB、bcl-2、hax蛋白的表达的变化.结果 低浓度的Ad.mda-7联合正常肝细胞半抑制浓度浓度的阿霉素(1.5 mg/L)使得细胞抑制率从阿霉素组的17.46%上升到79.5%,生长抑制逆转4.55倍(P＜0.05).联合化疗组MDR-1mRNA相对表达量从16.49±0.11下降至5.48±0.05.STAT-3 mRNA相对表达量从13.17±0.08上升至21.57±0.11.BCL-2及BAX表达与其他实验组相比较差异均有显著统计学意义(P＜0.05).联合实验组P-170蛋白的表达量较其他组明显降低,PKB蛋白表达量明显降低,磷酸化stat-3蛋白的表达量增加.结论 Ad.mda-7具有逆转肝癌细胞HepG2多药耐药的作用.其在下调MDR-1mRNA表达的同时,通过抑制PKB蛋白和活化STAT-3信号通路的表达降低促进肝癌细胞凋亡.     

腺病毒介导的mda-7／IL-24抑制肝癌VEGF和MMP-9的表达

目的 观察mda-7/IL-24基因对高转移性人肝癌细胞HCCLM6中VEGF和MMP-9的作用,从而探讨mda-7/IL-24基因在抑制肿瘤转移方面的作用.方法 构建Ad.Mda-7并转染至HCCLM6;transwell实验检测侵袭能力的变化;通过RT-PCR和Western Blot分别检测转染mda-7/IL-24基因前后VEGF和MMP-9表达mRNA和蛋白的变化;构建HCCLM6高转移型裸鼠模型,采用Ad.Mda-7肿瘤内注射法干预,观察mda-7/IL-24对裸鼠生存状况的影响和肿瘤内VEGF和MMP-9 的变化.结果 复制缺陷型腺病毒能介导外源基因mda-7/IL-24在肝癌细胞中高效表达;mda-7/IL-24能显著下调肝癌细胞中VEGF和MMP-9的表达.Ad.mda-7能延长裸鼠的生存时间,抑制肿瘤的生长,瘤体内VEGF和MMP-9表达明显降低(P<0.05).结论 mda-7/IL-24基因能明显抑制肝癌细胞的侵袭力,其机制可能与下调VEGF和MMP-9的表达有关.     

重组腺病毒介导MDA-7/IL-24对Hep3B选择性杀伤和抑制增殖的研究

目的观察黑色素瘤分化相关基因7（MDA-7／IL-24）基因对人肝癌细胞Hep3B和正常的肝细胞L02的作用，并且探讨其该作用机制。方法将携带人MDA-7／IL-24基因的腺病毒Ad.mda-7感染人正常肝细胞L02和肝癌细胞Hep3S，逆转录-聚合酶链式反应（RT—PCR）和ELISA方法观察MDA-7／IL-24基因的表达，噻唑蓝染色法（MTT）观察MDA-7／IL-24对肝癌细胞的生长抑制，Hoechst染色和Annexin-V和PI双染后流式细胞仪检二种细胞的凋亡，利用PI染色后流式细胞仪检测细胞周期，RT-PCR方法检测bcl-2的表达变化。结果Ad．mda-7能介导外源基因MDA-7／IL-24在肝癌细胞株Hep3B和正常细胞L02中高效表达，细胞培养上清液中MDA-7／IL-24蛋白的表达（Hep3B：L02分别为790：810ng／L）。MDA-7／IL-24能明显抑制肝癌细胞的生长（抑制率分别是83％和1．2％），能促进肝癌细胞的凋亡（58％：2．2％），阻滞肝癌细胞在G2／M期（48．29％：7．95％）。而对正常的肝细胞没有促凋亡和增殖阻滞作用；能明显的抑制Hep3B的凋亡抑制基因bcl-2的表达。结论Ad．mda-7能介导MDA-7／IL-24基因在人肝癌细胞中高效表达，选择性的杀伤肝癌细胞Hep3B，促进细胞增殖阻滞，其机制是通过抑制bcl-2的表达诱导肿瘤细胞凋亡。     

Circ0066629促进结直肠癌细胞活力的体外研究

目的探讨环状RNA circ0066629促进结直肠癌细胞活力作用及其调控的分子机制。方法 35例结直肠癌5-氟尿嘧啶(5-Fu)及伊立替康耐药和不耐药患者组织来源于南京医科大学附属上海市松江中心医院,不同结直肠癌细胞系来源于美国菌种保藏中心,利用RT-q PCR测定circ0066629在结直肠癌组织及细胞系中的表达水平。Circ0066629过表达质粒、siRNA质粒、miR-219a-2-3p过表达质粒(miR-219a-2-3p mimics)及miR-219a-2-3p干扰质粒(miR-219a-2-3p inhibitor)用于调控circ0066629和miR-219a-2-3p的表达。RT-q PCR用于测定转染效率。随后,应用CCK-8和细胞划痕实验测定LOVO细胞活力。荧光素酶报告基因实验用于评估circ0066629与miR-219a-2-3p以及p53与miR-219a-2-3p的靶向关系。蛋白免疫印迹实验用于测定p53和鼠双微体基因2(MDM2)在LOVO细胞中的蛋白表达水平。结果 circ0066629在结直肠癌5-Fu及伊立替康耐药患者组织中表达下调,但在不同结直肠癌细胞系中表达上调。过表达circ0066629明显促进了5-Fu和伊立替康处理下的LOVO细胞活力。MiR-219a-2-3p被预测为circ0066629的靶基因,并且miR-219a-2-3p过表达对LOVO细胞活力的作用与circ0066629相反。另外,p53是miR219a-2-3p的预测靶向基因,p53特异性抑制剂(PFT-α)明显抑制LOVO细胞活力。结论 circ0066629通过调控miR-219a-2-3p/P53/MDM2轴促进结直肠癌细胞活力。