兔角膜上皮细胞培养方法的建立及60Coγ射线照射后的形态定量学研究

建立角膜上皮细胞培养的方法,并观察电离辐射照射后的形态计量改变.用角膜组织块培养原代细胞并传至3代,以10、20、30和50Gy 60Coγ射线对离体细胞样品进行照射,观察照后不同时间其形态学改变,并用图像分析仪对细胞核、细胞浆的面积及核浆比进行定量分析.发现正常的角膜上皮细胞呈多角形或棱形,胞核位于细胞正中或偏中;照射后细胞胞核、胞浆明显增大,胞质内可见空泡,界限不清,核空泡化,核膜破裂,核浓缩、碎裂等.形态计量结果证明照后细胞核与细胞浆明显增大(p＜0.01),其核浆比随照后时间的延长而减小(p＜0.01),均以20～30Gy组最为明显,表明照射引起胞浆的改变(肿胀)比核更明显.本研究结果为进一步研究角膜上皮细胞的照射效应提供了基础.     

甾体皂苷化合物抑制血栓形成作用的研究

目的：观察甾体皂苷化合物(化合物9714)对血栓形成、血小板聚集及血液流变学的影响。方法：采用动静脉旁路血栓形成模型，测定化合物9714对血栓形成的影响；采用比浊法，测定其对大鼠血小板聚集的影响；采用大鼠急性血淤模型，测定其对血液流变学的影响。结果：化合物971410，20，40mg／kg组均能明显减轻血栓的干重及湿重；可抑制ADP、胶原诱导的大鼠血小板聚集；降低急性血淤大鼠的全血黏度、血浆黏度、红细胞聚集性，以及增强红细胞变形性。结论：化合物9714通过抑制血小板聚集、改善血液流变学来发挥其抗血栓形成作用。     

甾体皂苷化合物对局灶性脑缺血大鼠的保护作用

目的：研究甾体皂苷化合物(化合物9714)对局灶性脑缺血大鼠的影响。方法：采用FeCl3局部损伤血管，诱发血栓形成，造成局灶性脑缺血模型，观察化合物9714对模型大鼠神经症状、脑梗塞范围、脑水肿以及皮质血管脑血流量的影响。结果：化合物9714 20，40mg／kg组能明显减轻模型大鼠的神经症状及脑梗塞范围，增加模型大鼠的脑血流量；化合物9714 40mg／kg组能明显改善模型大鼠的患侧脑水肿程度，延长脑血流量下降50％所需时间。结论：化合物9714对血栓所致局灶性脑缺血性损伤具有明显的修复作用。     

原位末端标记和原位杂交技术的改进及其在骨髓细胞凋亡及调控中的应用

目的 细胞凋亡是细胞死亡的一种形式，是积极主动的生理过程，是在基因调控下细胞的主动死亡。利用文献报道的原位末端标记和原位杂交方法检测骨髓和其他含血细胞较多的组织中的细胞凋亡结果不理想。因此对两种方法进行改进。方法 LACA小鼠，随机分为0、2．5、4．0、5．5及7．0Gy5组。各组动物进行^60Coγ射线全身一次照射。照射后活杀取材，制作骨髓细胞涂片，采用(1)在已有的原位末端标记方法中将亲和素-辣根过氧化物酶(Avidln-HRP)改为碱性磷酸酶标记的抗生蛋白链菌素(AP-A)；显色剂由DAB改为坚固红。(2)在已有的原位杂交技术中将显色剂NBT和BC／P改为坚固红。结果 (1)改进后的原位末端标记方法显示凋亡的细胞核呈玫瑰红色；正常或未凋亡的细胞核呈浅蓝色，反差明显，背景清晰。(2)改进后的原位杂交显示bcl-2 mRNA阳性结果呈玫瑰红色，背景清晰，胞核复染呈浅蓝色，反差明显。结论 经改进后的原位末端标记和原位杂交技术阳性结果均呈玫瑰红色，胞核复染呈浅蓝色，反差明显，背景清晰。两种方法的改进，解决了长期不能使用原位末端标记和原位杂交技术进行骨髓细胞凋亡规律及调控研究的难题，为其提供了可靠的技术保障。两种方法联合应用于外周血和免疫器官包括脾脏、胸腺、淋巴结等含内源性过氧化物酶丰富的组织细胞凋亡及调控的研究取得了良好结果。因此，本方法值得从事含丰富过氧化物酶细胞如外周血细胞、骨髓造血细胞及免疫组织器官等凋亡及调控研究工作者推广应用。     

LACA小鼠骨髓辐射损伤后干细胞因子受体表达的免疫组化研究

目的至今，尚未见到采用免疫组化技术研究骨髓辐射损伤后干细胞因子受体（Ｃ－ｋｉｔ）表达及其在造血重建中的意义。方法经６０Ｃｏγ射线全身照射ＬＡＣＡ小鼠，于照射后４周内分批活杀动物，采用光镜、电镜及ＬＳＡＢ免疫组化方法，研究了辐射诱导的造血细胞凋亡及Ｃ－ｋｉｔ的表达及意义。结果全身照射ＬＡＣＡ小鼠时，５．５Ｇｙ为其亚致死剂量，此剂量照射小鼠可导致外周血白细胞及骨髓有核细胞数减少；骨髓明显损伤及损伤后重建现象；在照后１天内可使骨髓造血细胞发生凋亡；５．５Ｇｙ照射后６小时，Ｃ－ｋｉｔ蛋白于造血细胞浆内明显增多，呈强阳性；照后１０天，骨髓造血细胞增生、恢复，Ｃ－ｋｉｔ蛋白于造血细胞膜表达明显增多，呈强阳性。结论Ｃ－ｋｉｔ表达与造血功能重建有关，在早期造血功能重建中起重要调节作用。     

知母有效成分对拟痴呆模型大鼠学习记忆的影响及机制

目的研究知母有效成分(化合物9714)对拟血管性痴呆(VD)模型大鼠学习记忆的影响及其作用机制。方法采用双侧颈总动脉结扎(Commoncarotidarteryocclusion,CCAO)致拟VD模型大鼠,连续给药40d,以Morris水迷宫检测大鼠学习记忆能力,以免疫组化法检测大鼠脑皮质BDNF、ICAM1、VCAM1的表达。结果化合物971410、20、40mg·kg-1组能明显缩短定位航行试验中d2、d3的逃避潜伏期,提高空间搜索试验中原平台象限游泳距离占总距离的百分比(P<0.05,P<0.01);20、40mg·kg-1组能明显增加模型动物脑皮质BDNF的表达,降低脑皮质ICAM1的表达(P<0.05,P<0.01)。结论化合物9714能提高拟VD大鼠的学习记忆能力,同时对缺血后的神经元损伤、炎性损伤具有一定的保护作用。     

穿山龙中甾体皂苷的分离鉴定

 目的分离、鉴定穿山龙即穿龙薯蓣(Dioscorea nipponica Makino)根茎中的甾体皂苷类化合物。方法采用溶剂提取、硅胶柱色谱及制备高效液相色谱等方法进行分离,通过化学和光谱学方法鉴定化合物的结构。结果分离得到4种甾体皂苷类化合物,其化学结构分别鉴定为:薯蓣皂苷(Ⅰ),纤细薯蓣皂苷(Ⅱ),26-O-β-D-吡喃葡萄糖基25(R)-22-羟基-呋甾-△⁵⁽⁶⁾-烯- 3β,26-二羟基-3-O-{[α-L-吡喃鼠李糖基(1→2)]-α-L-吡喃鼠李糖基(1→4)}-β-D-吡喃葡萄糖苷(Ⅲ),26-O-β-D-吡喃葡萄糖基25(R)-22-羟基-呋甾-△⁵⁽⁶⁾-烯-3β,26-二羟基-3-O-{[α-L-吡喃鼠李糖基(1→2)]-β-D-吡喃葡萄糖基(1→3)}-β-D-吡喃葡萄糖苷(Ⅳ)。结论化合物Ⅲ,Ⅳ为首次从穿龙薯蓣中分离得到的呋喃甾烷型皂苷。     

c-myc基因在辐射诱导骨髓细胞凋亡和修复中表达及意义

迄今,c-myc基因表达在辐射诱导的骨髓造血细胞凋亡及修复中变化和意义于国内外同类文献尚未见到。本实验采用78只LACA小鼠,经γ射线全身照射,于照后4周内分批活杀,将骨髓组织石蜡包埋制片,H-E染色和制作电镜标本进行电镜观察,并将骨髓细胞涂片采用LSAB免疫细胞化学染色,动态观察c-myc蛋白在辐射诱导骨髓造血细胞凋亡及修复中变化。结果表明:照后小鼠骨髓出现明显损伤及损伤后重建现象。照后6小时,骨髓中凋亡的造血细胞明显增多,形态上表现为核染色质浓缩、边移,呈半月形、环状、戒指状或不规则状,并见凋亡小体。c-myc蛋白于照后6小时明显增多,位于造血细胞核内,而照后1-6天,其表达则进行性减少,至照后10-15天,c-myc蛋白再度增多,于照后21天后,c-myc表达趋于正常水平。因此,c-myc基因在辐射诱导的骨髓造血细胞凋亡及凋亡后的修复中表达均明显增多,可能参与了辐射诱导的造血细胞凋亡及修复过程。