TGFβ1正、反义基因转染60Co照射HELF对TGFβ1及I型前胶原mRNA表达调控影响

目的　观察TGFβ1正、反义基因转染6 0 Coγ射线照射的HELF后对其TGFβ1mRNA及Ⅰ型前胶原mRNA表达调控的影响。方法　采用脂质体介导法进行基因稳定转染 ,转染细胞经PCR ,DNAdotblot鉴定和RNAdotblot分析。结果　选择 5Gy照射细胞 ,采用LipofectAMINE将TGFβ1正、反义基因表达载体pMAMneo TGFβ1和pMAMneo AntiTGFβ1转入HELF ,转染细胞经G418抗性筛选出来 ,并且在糖皮质激素地塞米松诱导下培养。提取培养细胞的RNA和染色体DNA ,转染细胞DNA与地高辛标记的neo特异探针杂交阳性 ,且可用neo基因特异的PCR引物扩增出 2 76bp的阳性片段。对提取的RNA用地高辛标记的TGFβ1探针和α1(Ⅰ )寡核苷酸探针经RNAdotblot分析表明 ,转染pMAMneo AntiTGFβ1的细胞其TGFβ1mRNA水平下降 ,而转染pMAMneo TGFβ1的细胞其TGFβ1mRNA水平则升高。对于Ⅰ型前胶原mRNA ,前者表达水平比未转染细胞低 ,后者则略高。 结论　TGFβ1反义基因转染6 0 Coγ射线照射的人胚肺成纤维细胞后可以使细胞中TGFβ1mRNA含量水平减少 ,使Ⅰ型前胶原mRNA表达水平降低     

辐射诱导骨髓细胞凋亡及相关基因表达研究

目的 研究辐射诱导骨髓细胞凋亡、bcl-2和p53基因表达及意义。方法 γ射线全身照射小鼠,采用原位末端标记、原位杂交和图像分析等技术,骨髓细胞凋亡及bcl-2和p53表达。结果 照射后6h骨髓细胞凋亡;bcl-2于细胞凋亡时减少,而于其后修复早期增加;p53于造血细胞凋亡及之后修复均增多,mtp53仅其修复时阳性。结论 辐射可导致骨髓细胞凋亡,且呈剂量相关性;bcl-2与p53基因均参与其凋亡和修复过程。     

γ-干扰素和地塞米松对成纤维细胞生长的影响

目的观察γ干扰素（ＩＦＮγ）和地塞米松（Ｄｅｘａ）对正常和ＩＬ１刺激的成纤维细胞生长的影响,旨在从细胞因子角度为抗纤维化有效措施的制定提供依据。方法用ＭＴＴ比色、ＡｇＮＯＲｓ银染和免疫组化技术,观察两种抑制剂对成纤维细胞增殖、ＡｇＮＯＲｓ合成和Ⅲ型胶原表达的影响。结果２５０×１０３Ｕ／Ｌ浓度的ＩＦＮγ和１００μｇ／Ｌ浓度的Ｄｅｘａ均能明显抑制正常和ＩＬ１刺激的成纤维细胞增殖、ＡｇＮＯＲｓ合成和Ⅲ型胶原表达。结论一定浓度的ＩＦＮγ和Ｄｅｘａ对正常和ＩＬ１刺激的成纤维细胞生长、增殖、ＡｇＮＯＲｓ合成和Ⅲ型胶原表达均显示出明显的抑制作用。     

放射性肝纤维化的免疫组化研究

６０Ｃｏγ射线照射大鼠肝区后，不同时间分批活杀，进行肝脏病理（常规及多种免疫组化染色）研究。结果表明：单次照射病变明显重于分次照射且发生时间早；照后早期枯否细胞增多为显著，而晚期贮脂细胞增多为明显，胞浆内Ⅳ型胶原呈强阳性；纤维连接蛋白在肝纤维化早期明显增多，晚期则为胶原所取代；层粘连蛋白及Ⅳ型胶原在窦壁沉积进行性增多，可见完整基膜包绕肝窦，使之呈毛细血管化；肝细胞浆内纤维连接蛋白、Ⅲ及Ⅳ型胶原增多．最后，作者对上述肝间质成分变化在放射性肝纤维化中的作用进行了讨论．     

胡芦巴来源的甾体皂苷研究进展

中药胡芦巴是豆科一年生草本植物胡芦巴（Trigonellafoenum—graecumL．）的干燥种子,富含甾体皂苷。本实验室对胡芦巴中甾体皂苷进行了系统研究,包括原生呋甾皂苷及其酶解产物的分离鉴定、利用液质联用技术对甾体皂苷类成分的快速表征与结构分析,以及利用超临界流体色谱技术对螺甾皂苷C-25R／S异构体的分析、制备分离等。本文对本实验室相关研究进行总结,以期有助于胡芦巴的开发与利用,也为今后中药的化学成分研究工作提供借鉴。     

利用UHPLC/Q-TOF MS技术进行知母中7个甾体皂苷的含量测定(英文)

本文利用UHPL C/Q-TOFMS技术建立了知母中7个主要甾体皂苷的含量测定方法,它们分别为知母皂苷N,知母皂苷E1,知母皂苷BⅡ,知母皂苷B,知母皂苷Ⅰ,知母皂苷A2和知母皂苷AⅢ。色谱柱为ACQUITY UPLC HSST3柱(2.1mm×100mm,1.8μm),流动相为乙腈–水(0.1%甲酸)梯度洗脱,分析时间为18分钟;LOQ和LOD分别为0.18–0.75ng/μL和0.05–0.22ng/μL;7个甾体皂苷分别在一定范围内呈现良好的线性关系,相关系数分别为0.9902–0.9979,且日内及日间精密度均低于5%,回收率为97.13%–101.98%。该方法快速、准确、重现性好,适用于知母药材及知母配方颗粒中7个甾体皂苷的含量测定。     

正常和放射复合伤口血管再生中VEGF基因的表达及其意义

目的 研究VEGF基因在正常和放射复合伤口愈合中的表达及意义,探讨其在血管再生中的作用。方法 将48只Wistar二级大鼠背部皮肤造成圆形伤口后,以25Gy ^60Co γ射线局部照射,于伤后2、5、10、15、21和28d活杀取材,采用免疫组织化学、原位杂交和原位PCR等方法,研究VEGF基因的表达及意义。结果：单纯创伤组于伤后2d,新生血管内皮细胞浆内VEGF的表达呈弱阳性;而于10d后,VEGF的表达逐渐减少。创伤＋照射组则于伤后5d,VEGF的表达在血管内皮细胞胞浆内呈弱阳性,10d时阳性,15d后则呈弱阳性。原位杂交,VEGF mRNA于单纯创伤组伤后2－5d及创伤＋照射组伤后5－10d,血管内皮细胞浆内阳性。原位反转录PCR则显示,VEGF mRNA于单纯创伤组后2－15d及创伤＋照射组伤后5－28d,呈阳性反应。结论 内源性VEGF基因的表达参与创伤愈合中血管再生过程。辐射使血管内皮细胞中VEGF的表达减少。原位反转录PCR方法较原位杂交能客观地反映内源性VEGF基因的表达情况。     

Effect and mechanism of electronic magnetic pulse on peripheral lymphocytes in dogs

目的　研究电磁脉冲 (EMP)对犬淋巴细胞的损伤效应 ,并探讨其作用机理。方法　用酸性磷酸酯酶细胞化学方法检测T、TH 和TS 淋巴细胞 ,用原位末端标记和免疫细胞化学技术分析淋巴细胞凋亡和Bcl 2、Bax蛋白的改变。结果　 (2 - 12 )× 10 4 V/m的场强能使外周血T细胞及其亚群出现明显降低 ;凋亡淋巴细胞随照射剂量的增加而明显升高 ;不同剂量照射后 10天 ,淋巴细胞Bax蛋白的表达明显增强 ,与淋巴细胞凋亡呈现出比较好的相关性 ,而Bcl 2蛋白显著降低。结论　首次证实一定场强的EMP确实能损伤淋巴细胞 ,并呈现出较好的剂量效应关系。淋巴细胞凋亡是EMP引起淋巴细胞死亡和机体免疫功能降低的主要原因 ,Bax和Bcl 2在上述凋亡调控中起着重要作用。     

TGFβ1正、反义基因转染60Co照射HELF对TGFβ1及I型前胶原mRNA表达调控影响

目的 观察TGFβ1正、反义基因转染^60Coγ射线照射的HELF后对其TGFβ1、mRNA及Ⅰ型前胶原mRNA表达调控的影响。方法 采用脂质体介导法进行基因稳定转染,转染细胞经PCR,DNA dot blot鉴定和RNA dot blot分析。结果 选择5Gy照射细胞,采用Lipofect AMINEuqf TGFβ1正、反义基因表达载体pMAM-TTGFβ1pMAMneo-AntiTGFβ1转入HELF,转染细胞经G418抗性筛选出来,在糖皮质激素地塞米松诱导下培养。提取培养细胞的RNA和染色体DNA,转染细胞DNA与地高辛标记的neo特异探针杂交阳性,且可用neo基因转导的PCR引物扩增出276bp的阳性片段。对提取的RNA地高辛标记的TGFβ1探针和α1（Ⅰ）寡核苷酸探针经RNA dot blot分析表明,转染pMAMneo-AntiTGFβ1的细胞其TGFβ1 mRNA水平下降,而转染pMAMneo-TGFβ1的细胞其TGFβ1 mRNA水平则升高。对于Ⅰ型前胶原mRNA,前者表达水平比未转染细胞低,后者则略高。结论 TGFβ1反义基因转染^60Co γ射线照射的人胚肺成纤维细胞后可以使细胞中TGFβ1 mRNA含量水平减少,使Ⅰ型前胶原mRNA表达水平降低。     

北京生物工程研究所(张兆山);北京基础医学研究所(龙建银、王会信)TGF β1反义基因及表达荧光素酶的重组腺病毒对放射性肺纤维化体内基因治疗初探

目的探索TGFβ1反义基因和脂质体混合物以及重组腺病毒转移载体进行放射性肺纤维化体内基因治疗的可行性.方法通过支气管插管与滴注的方式进行.结果检测分析表明,转基因后1.5 d,肺组织DNA用neo基因特异引物PCR扩增阳性;第5.5天,PCR扩增67%(2/3)阳性.RNA dot blot分析表明,转染TGFβ1反义基因的肺组织TGFβ1 mRNA含量降低.转染35 d后取动物肺组织测定其羟脯氨酸含量表明,尽管转染TGFβ1反义基因的动物其肺组织羟脯氨酸含量比正常对照组高(P＜0.01),但它比生理盐水治疗对照组动物和转染TGFβ1正义基因的动物其肺内羟脯氨酸含量低(均为P＜0.01).用含有荧光素酶基因的复制缺陷型腺病毒感染大鼠,其肺脏均检测到了有荧光素酶活性蛋白的表达.结论由聚阳离子脂质体介导的TGFβ1反义基因进行的肺纤维化体内基因治疗是一个简单易行的方法,它可以减缓肺纤维化的发生;用复制缺陷的重组腺病毒进行肺脏的基因治疗是一种较为理想的方法,有望成为治疗肺纤维化的有效的新途径.