乙肝病毒HBsAg-EGFP融合蛋白真核表达载体构建及稳定转染Chang Liver细胞系的建立

目的 构建可表达乙型肝炎病毒(HBV)HBsAg-EGFP融合蛋白的真核表达载体;获得重组质粒稳定转染的Chang Liver细胞系.方法 利用PCR技术从HBV基因组中扩增出HBsAg基因片段,BamH I/EcoR l双酶切后连接到经同样酶切的pEGFP-N1真核表达载体,转化TG1菌株感受态细胞,获得阳性重组质粒pEGFPNl.HBsAg.将阳性克隆用脂质体法转染Chang Liver细胞,经持续G418压力选择和有限稀释法克隆化获得稳定转染的细胞系.结果 成功构建了真核表达载体pEGFPN1-HBsAg;建立了其重组质粒稳定转染的Chang Liver细胞系.结论 重组质粒稳定转染的Chang Liver细胞系可表达HBsAg-EGFP融合蛋白;该细胞系可以用于筛选HBsAg转染细胞后,差异表达的蛋白质研究,为深入研究HBsAg可能的致病机制提供依据.     

干细胞研究及其实验室鉴定

干细胞 (StemCells)研究是当前生命科学中备受关注的领域之一 ,在 1999年末美国《时代》杂志的年度世界十大科技成果评选中 ,干细胞研究名列榜首 ;2 0 0 0年干细胞研究再次被《科学》杂志列为当年世界十大科技成就之一。干细胞是人体内最原始的细胞 ,它具有很强的再生能力 ,是认识细胞生长、分化等基本生命原理的可靠研究材料 ,因此 ,对干细胞的研究将极大促进揭示人体发生发展进程的奥秘 ,并可能给现代临床医疗模式带来革命性变化[1]。一、干细胞定义及分类1.干细胞的定义 :干细胞即起源细胞。一般而言 ,干细胞指同时具有自我更新及多向分…     

磷酸脂酶抑制剂冈田酸对HepG2.2.15细胞中乙型肝炎病毒复制的影响

 目的 初步鉴定可能与 HBV 核心蛋白去磷酸化有关的磷酸酯酶。 方法 以磷酸酯酶 2A 抑制剂冈田酸（OA）处理体外培养的人肝癌 HepG2.2.15 细胞。将细胞分为 4 组，分别加入终浓度为 0（对照组）、10、20、30 ng/ml 的 OA（OA 10 ng 组、OA 20 ng 组、OA 30 ng 组），每组各设 5 孔。在培养 0、2、4、6 d 时分别收集各组细胞培养上清液，采用电化学发光方法检测 HBsAg 浓度，荧光实时定量 PCR 方法检测 HBV DNA 拷贝数。取培养 2 d 时的各组细胞，采用蛋白质印迹方法检测 HBcAg 异质性，免疫荧光细胞化学染色方法检测 HBcAg 亚细胞定位。 结果 OA 10ng 组、OA 20 ng 组各时间点细胞培养上清液HBsAg 浓度、HBV DNA 拷贝数分别与对照组相应各时间点比较，差异均无统计学意义；在培养 2 d 时 HBcAg 电泳条带、亚细胞定位分别与对照组比较均无明显异常。OA 30 ng 组在培养 2、4、6 d 时细胞培养上清液 HBsAg 浓度（ng/ml）均明显低于对照组相应各时间点（分别为 385.9 ± 43.1 vs. 510.2 ± 63.3、346.5 ± 39.6 vs. 484.6 ± 59.4、295.1 ± 32.8 vs. 467.2 ± 52.9，P 值分别为 0.028、0.022、0.016）；在培养 2 d 时细胞培养上清液 HBV DNA 拷贝数（ml-1）明显高于对照组相应时间点（6.71 ± 6.07 vs. 6.34 ± 5.72，P = 0.022），而在培养 4、6 d 时均明显低于对照组相应各时间点（分别为 5.80 ± 5.19 vs. 6.29 ± 5.68、4.75 ± 4.15 vs. 6.25 ± 5.58，P 值分别为 0.008 和 0.005）；在培养 2 d 时 HBcAg 电泳条带明显增宽，约 20% 的 HepG2.2.15 细胞的细胞核内 HBcAg 红色荧光信号明显增强。 结论 短时间、高浓度的 OA 处理可提高 HBV DNA 的复制水平和核心蛋白的磷酸化水平，提示磷酸酯酶 2A 可能参与了 HBV 核心蛋白的去磷酸化过程。     

QSG-7701和HepG2细胞支持不同乙型肝炎病毒复制模式及其机制

目的研究QSG-7701及HepG2细胞支持HBV复制模式的差异及其内在机制。方法质粒PUC18-HBV1.2转染QSG-7701与HepG2细胞后定量检测细胞上清液中HBV DNA和HBsAg;采用基因芯片技术比较分析二者基因表达差异并用实时定量PCR验证。结果HepG2细胞在转染后6 d内培养上清液可检出HBV DNA及HBsAg,QSG-7701细胞转染后2周内均可检出HBV DNA及HBsAg,且HBV DNA在10 d内保持相对稳定的高水平复制(1×107～3×107拷贝/ml);基因芯片检测结果示QSG-7701细胞中与HBV生活周期相关的因予如HLF、RXRα、IL-6高表达,而HBxIP、SPIK1为低表达,MMP3不表达。结论QSG-7701支持高水平的HBV复制,并可维持cccDNA池的相对稳定,基因差异表达可能为二者支持不同HBV复制模式提供解释。     

案例基础上超前护理对慢性乙型肝炎肝衰竭患者的影响

目的 探讨案例基础上超前护理对慢性乙型肝炎肝衰竭患者恢复的影响。方法 选取2019年2月至2021年5月浙江大学医学院附属第二医院临平院区收治的慢性乙型肝炎肝衰竭患者120例,根据随机数字表法将其分为对照组和试验组,每组各60例。对照组患者给予常规护理,试验组患者在对照组的基础上实施案例基础上超前护理,两组患者的护理周期均为患者入院至出院前,比较两组患者干预前后的焦虑自评量表（self rating anxiety scale,SAS）、抑郁自评量表（self rating depression scale,SDS）、健康调查量表36（36–item short form health survey,SF–36）评分及肝功能变化。结果 干预后,两组患者的SAS、SDS评分及血清谷丙转氨酶（alanine aminotransferase,ALT）、总胆红素（total bilirrbin,TBil）水平均显著低于干预前（P<0.05）,SF–36各维度评分和白蛋白（albumin,Alb）均显著高于本组干预前（P<0.05）;试验组患者的SAS、SDS评分及血清ALT、TBil水平均显著低于对照组（P<0.05）,SF–36各维度评分及Alb水平均显著高于对照组（P<0.05）。结论 采取案例基础上超前护理,可缓解慢性乙型肝炎肝衰竭患者的负性情绪,提高患者对疾病的认知,提高生活质量,从而改善患者的肝功能。     

细胞人基因组DNA对荧光实时定量PCR检测细胞培养液中HBV DNA的影响

 目的 研究细胞人基因组 DNA 对荧光实时定量 PCR（FQ-PCR）检测细胞培养上清液中 HBV DNA 含量的可能干扰影响，提高细胞培养上清液中 HBV DNA 定量检测的准确性。方法 取 HBV DNA 阳性血清，以 DMEM 培养基分别配制出 HBV DNA 拷贝数为 5 × 107/ml（高拷贝组）、5 × 105/ml（中拷贝组）、5 × 103/ml（低拷贝组）的不同样本组；各组内再分 5 个亚组，分别加入终浓度为 0（对照组）、12.5、25、50、100 μg/ml 的细胞人基因组 DNA（提取自人肝癌细胞系 HepG2）。以不含 HBV DNA 阳性血清的 DMEM培养基加入上述浓度细胞人基因组 DNA 为空白组。采用基于 TaqMan 技术的 FQ-PCR 检测各组样本的 HBV DNA 拷贝数并绘制 HBV DNA 定量曲线。每组均重复检测 10 次。根据 HBV DNA 定量检测结果确定受干扰样本和未受干扰样本，分别计算其定量曲线线性期斜率和平均扩增效率。 结果 高拷贝组中加入不同浓度细胞人基因组 DNA 的各个亚组与相应对照组比较，HBV DNA 拷贝数差异均无统计学意义。中拷贝组中加入细胞人基因组 DNA 浓度为 50 和 100 μg/ml 的 2 个亚组，其 HBV DNA 拷贝数结果明显高于相应对照组，增高可达 50 ~ 100 倍，且重复性差。低拷贝组中只有加入细胞人基因组 DNA 浓度为 12.5 μg/ml的亚组可通过提高基线值取得与相应对照组接近的定量检测结果，而其他亚组 HBV DNA 定量曲线指数扩增期斜率明显异常，无法确定其定量检测结果。空白组各亚组均未观察到明显的 HBV DNA 指数扩增期。受干扰样本线性期斜率（-1.01 ± 0.06）和平均扩增效率（90.0% ± 2.1%）与对照组样本（分别为 -1.52 ± 0.06，97.0% ± 0.4%）比较，差异均有统计学意义（P < 0.01）。 结论 细胞人基因组 DNA 对应用 FQ-PCR 技术进行的HBV DNA 定量检测可产生非特异性干扰，尤其在 HBV DNA 拷贝水平较低时。在细胞培养上清液作 HBV DNA 定量检测时应尽量去除细胞人基因组 DNA。     

授权教育饮食联合心理干预在病毒性肝炎后肝硬化中的应用

  目的  探讨授权教育饮食联合心理干预在病毒性肝炎后肝硬化患者中的应用效果。  方法  选取2020年1月—2021年1月浙江大学医学院附属第二医院临平院区感染科收治的病毒性肝炎后肝硬化患者120例,以随机数字表法分为研究组、对照组各60例。对照组按照常规护理流程进行干预,研究组在常规护理的基础上实施授权教育饮食联合心理干预,2组患者均干预3个月。观察比较2组患者干预前后健康知识与遵医行为评分,肝功能指标、营养状况指标。  结果  干预后,2组健康知识评分较干预前提高且研究组高于对照组,同时2组遵医行为评分较干预前提高且研究组高于对照组(均P＜0.05);干预后,研究组患者ALT、总胆红素(TBIL)低于对照组[(51.03±6.62)U/L vs. (55.27±6.71)U/L,(54.87±8.54)μmol/L vs. (60.33±8.61)μmol/L,均P＜0.05];研究组Alb、Hb、BMI水平高于对照组[(31.02±5.08)g/L vs. (21.56±4.78)g/L,(114.07±11.09)g/L vs. (101.95±10.87)g/L,21.25±2.04 vs.20.07±2.01,均P＜0.05]。  结论  给予病毒性肝炎后肝硬化患者授权教育饮食联合心理干预,可提高患者对疾病健康知识认知与遵医行为,改善营养状况,继而改善肝功能。      

乙型肝炎病毒促进Ⅰ型胶原和Ⅲ型胶原在肝星状细胞中的表达

目的:研究转染HBV的HepG2.2.15细胞株在体外促进肝星状细胞中Ⅰ、Ⅲ型胶原的表达,进而探讨HBV促肝细胞纤维化的机制.方法:将HepG2和HepG2.2.15细胞株分别在体外与肝星状细胞共培养,以单独培养的肝星状细胞为对照组.取培养后24、48、72 h 3个时间点.以RT-PCR定量检测肝星状细胞中Ⅰ、Ⅲ型胶原mRNA的表达:以Westem blot定量检测肝星状细胞中Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白的表达.结果:与对照组和与HepG2共培养的肝星状细胞比较,与HepG2.2.15共培养的肝星状细胞中Ⅰ、Ⅲ型胶原mRNA的表达明显增高,以72 h差异最为显著(P<0.01);与HepG2.2.15共培养的肝星状细胞中Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白的表达也明显增高,以48 h差异最为显著(P<0.01).结论:与HepG2.2.15细胞株共培养后,肝星状细胞中肝纤维化相关因子的表达明显增强,HBV具有诱导肝细胞纤维化的重要作用.     

乙型肝炎病毒促进CTGF和TGF-β1在肝星状细胞中的表达

目的:研究转染乙型肝炎病毒(HBV)的HepG2.2.15细胞株在体外促进肝星状细胞中CTGF和TGF-β1的表达,进而探讨HBV促肝细胞纤维化的机制.方法:将HepG2和H印G2.2.15细胞株分别在体外与肝星状细胞(Lx-2)共培养,以单独培养的肝星状细胞为对照组.培养24,48,72 h后,以Real-time PCR定量检测肝星状细胞中CTGF和TGF-β1 mRNA的表达,以Western blot定量检测其蛋白表达.结果:与对照组比较,在24、48、72 h时点,CTGF和TGF-β1 mRNA分别增高约1.7、4.2、9.6倍(P＜0.01)和2.2、6.1、8.1倍(P＜0.01),以72 h差异最为显著;而与HepG2细胞共培养实验组LX-2细胞CTGF和TGF-β1 mRNA在三个时间点分别增高约1.7、1.2、1.3倍(P＜0.05)和2.7、1.9、2.1倍(P＜0.05).CTGF和TGF-β1蛋白表达量分别增高约2.1、2.6、2.5倍(P＜0.01)和1.7、3.3、3.1倍(P＜0.01),以48 h差异最为显著;而与HepG2细胞共培养实验组LX-2细胞CTGF和TGF-β1蛋白表达量在三个时间点分别增高约1.6、1.1、0.9倍(p＜0.05)和1.1、1.4、2.5倍(P＜0.05).结论:与HepG2.2.15细胞株共培养后,肝星状细胞中肝纤维化相关因子的表达明显增强.体外实验证明HBV具有诱导肝细胞纤维化的重要作用.     

新生儿网织红细胞参考值的动态变化及探讨

目的 探讨正常新生儿网织红细胞参考值范围的动态变化及与日龄的关系。方法 用Beckman-Coult公司的stks-3B全自动血细胞分析仪对115例1－10d正常新生儿的静脉血织红细胞值进行分析，并同时与国际血液标准化委员会（ISCH）所推荐的网织红细胞活体染色显微镜计数－Miller窥盘法进行比较，将所得结果进行统计学处理。结果 1d、2d、3d、4d与5－7d新生儿组结果之间存在着高度显著性差异（P＜0．01）；5－7d网织红细胞值降至0．3％－1．1％；8－10d的新生儿网织红细胞值与5－7d新生儿网织红细胞值之间无显著性差异（P＞0．05）；且血细胞分析仪测定法与Miller窥盘法测得新生儿网织红细胞值之间均无显著性差异（P＞0．05）。结论 新生儿网织红细胞参考值范围与日龄呈显著相关，并应注意其低值期的存在；血细胞分析仪法可作为Miller窥盘法的替代方法测定新生儿网织红细胞。、、、、、