miRNA－92a在缺血再灌注肾损伤中的表达变化

目的观察miRNA-92a在缺血再灌注（I／R）损伤4h、24h后小鼠肾组织的表达变化,探讨肾脏缺血损伤后血管生成的可能机制。方法采用双侧夹闭小鼠肾蒂的方法制备急性缺血再灌注肾损伤模型,术后灌注24h后收集血清和。肾脏标本,分别检测肾功能及观察肾组织病理学改变。实时定量逆转录聚合酶链反应（real—time RT-PCR）的方法检测小鼠I／R损伤4h和24h组中miRNA-92a的表达水平。结果（1）采用血清肌酐（Scr）和尿素氮（UN）评估肾功能,肾脏I／R 24h组与假手术组（sham）比较有显著性差异（P〈0．05）;HE染色观察肾组织病理改变明显,肾缺血再灌注模型成功。（2）而I／R4h和24h后,miRNA-92a的表达上调,其上调倍数分别为3．23±0．74．1．53±0．33（P〈0．05）。结论小鼠I／R损伤中miRNA-92a表达显著上调,miRNA-92a可能参与缺血再灌注肾组织损伤的血管再生的调控过程。     

脑外伤后小鼠海马区notch信号的表达变化

目的观察脑外伤后小鼠海马区notch信号基因的表达变化。方法采用Feeney自由落体法复制闭合性脑外伤小鼠模型,分为假手术对照组和脑外伤组,于伤后4h、1d、3d分别处死。采用实时荧光定量PCR法检测伤后各时间点notch1、hes1mRNA的表达。结果 （1）notch1 mRNA表达水平在伤后4h开始升高,1d时达到高峰,较对照组升高约6倍,3d时有所回落,但仍维持在高水平,较对照组升高2倍。（2）hes1 mRNA在伤后4h无明显变化,1d时达到高峰,较对照组升高3倍,3d时回落到正常水平。结论脑外伤后notch1和hes1 mRNA明显增高,提示notch信号被激活,可能与伤后NSCs增殖分化相关。     

氯化镧阻断LPS诱导巨噬细胞钙信号通路激活及TNF-α释放

目的探讨氯化镧（LaCl3）对脂多糖（Lipopolysaccharide,LPS）诱导巨噬细胞钙信号通路激活及肿瘤坏死因子α（TNF-α）释放的影响。方法将巨噬细胞RAW 264.7随机分成四组：LPS组（培养液中含1μg/ml LPS）,LaCl3＋LPS组（以含2.5μmol/ml LaCl3的培养基孵育细胞一定时间后,再予以1μg/ml LPS刺激）,LaCl3组（培养液中含2.5μmol/ml LaCl3）及对照组（培养液中不含LaCl3和LPS）。于不同时间点分别收集各组细胞及其培养上清待测。以Fluo-3/Am加载细胞,经上述不同分组处理一定时间后,流式细胞术观察细胞内Ca2＋浓度（[Ca^2＋]i）的变化;采用酶联免疫吸附试验（ELISA）检测上清中TNF-α水平。结果流式细胞术测定结果显示：LPS组细胞内[Ca^2＋]i为（336.67±26.16nmol/L）,与对照组比较差异显著（P〈0.01）;LaCl3＋LPS组（162.67±26.41nmol/L）显著低于LPS组（P〈0.01）;LaCl3组（29.84±6.42nmol/L）与对照组相比略低但无统计学意义（P〉0.05）。LPS组细胞培养上清TNF-α含量（152.19±15.68pg/ml）与对照组相比,显著升高（P〈0.01）;而LaCl3＋LPS组细胞培养上清中TNF-α含量为43.95±6.55 pg/ml,与LPS组相比显著下降（P〈0.01）且与对照组相比无差异;LaCl3组细胞培养上清中TNF-α含量（27.84±3.73pg/ml）与LPS组相比显著下调（P〈0.01）,并且与对照组相比亦显著下调（P〈0.05）。结论一定浓度的LaCl3可阻断LPS诱导巨噬细胞钙信号通路激活及抑制TNF-α的释放。     

胚胎干细胞研究进展

胚胎干细胞（embryonic stem cells．ESCs）是由动物或人囊胚的内细胞团（inner cell mass，ICM）或原始生殖细胞（primordial germ cells，PGCs）分离出来，经体外分化抑制培养筛选出的具有全能性的胚胎细胞。经适当的因子诱导，ESCs可以分化成一种或多种细胞类型。自1981年英国剑桥大学的Evans和Kaufman等用不同的方法成功地分离、建立了小鼠ESCs系以来．历经将近20年，第一株人ESCs系在美国威斯康星大学成功建立。同一年．     

大鼠骨髓源性血管内皮祖细胞的体外培养与鉴定

目的:目前内皮祖细胞主要从骨髓、脐带血和外周血获取,但其分离培养方法尚不成熟,外周血来源因损伤小、易获取而被普遍使用,但得到的内皮祖细胞纯度较低.实验拟探讨大鼠骨髓来源内皮祖细胞体外培养、诱导扩增和生物学特性鉴定方法.方法:实验于2006-08/2007-08 在南昌大学第一附属医院泌外研究所完成.①实验材料:2周龄SD大鼠由南昌大学医学院动科部提供,雌雄不拘,清洁级,实验过程中对动物处置符合动物伦理学标准.②实验方法:应用梯度离心法采集大鼠骨髓单个核细胞,贴壁筛选法分离内皮祖细胞,置于添加了血管内皮细胞生长因子、人碱性成纤维细胞生长因子、白血病抑制因子、表皮生长因子的M199培养液中扩增培养,对培养2周的细胞采用免疫荧光染色鉴定细胞标志物血管性血友病因子、血管内皮生长因子受体-2、CD34、CD133, 采用RT-PCR法检测内皮细胞特异性分子标志血管性血友病因子、FLK-1、Tie-2、CD34、CD133、eNOS基因表达.结果:①培养4 d,光电显微镜下可见细胞集落形成,梭形贴壁细胞从集落中央以放射状向外周生长.培养7～10 d,细胞集落相互连接,呈典型的"鹅卵石"样外观.2周左右可见细胞排列成条索状结构并可呈"微血管样"排列生长.②贴壁细胞免疫荧光染色鉴定细胞标志物血管性血友病因子、FLK-1、CD34、CD133阳性,RT-PCR法检测内皮细胞特异性分子标志血管性血友病因子、FLK-1、Tie-2、CD34、CD133、eNOS基因阳性表达.结论:采用梯度离心法从骨髓中分离单个核细胞,经诱导培养可实现内皮祖细胞的分离培养和体外扩增.     

脑缺血预处理后Caspase-8蛋白的表达与神经元的保护作用

目的探讨脑缺血预处理后凋亡相关基因 Caspase- 8蛋白表达与神经元保护作用的关系. 方法雄性 Wistar大鼠 70只,随机分为对照组( 10只)、预处理组( 10只)、缺血预处理组( 25只)和缺血组( 25只).四血管阻断法复制全脑缺血模型,尼氏和 TUNEL染色法观察脑皮质及海马 CA1区神经元数和凋亡细胞数,免疫组化方法检测 Caspase- 8蛋白在缺血预处理后表达变化情况. 结果①缺血 7 d时,缺血预处理组皮质及海马 CA1区神经元数无显著变化 [( 268± 8.5)个 /视野 ],缺血组神经元数则显著减少 [(135.0± 5.6)个 /视野 ].②缺血预处理组 Caspase- 8蛋白缺血 12 h表达升高 [( 125.6± 9.0)个 /视野 ], 24 h达高峰 [( 167.0± 8.1)个 /视野 ]; 缺血组 caspase- 8蛋白缺血 6 h表达升高 [( 154.2± 18.4)个 /视野 ], 12 h达高峰 [( 222.8± 17.1)个 /视野 ];各对应时点缺血组 Caspase- 8蛋白阳性表达细胞较缺血预处理组明显增多.③缺血预处理组和缺血组均在缺血 12 h皮质及海马 CA1区凋亡细胞数开始增多 [( 15.5± 2.1), (39.8± 3.9)个 /视野 ],缺血 48 h凋亡细胞数达高峰 [( 68.3± 13.6), (328.4± 24.0)个 /视野 ],但缺血组凋亡细胞数较缺血预处理组显著增多. 结论全脑缺血可能通过诱导 Caspase- 8蛋白的表达增多,启动细胞凋亡,导致缺血后神经元凋亡的发生.缺血预处理延缓并降低缺血后 Caspase- 8蛋白表达并减少细胞凋亡的发生可能是其神经元保护作用机制之一.     

自体骨髓间充质干细胞移植治疗中枢神经系统损伤性疾病(附五例报告)

目的：探讨自体骨髓间充质干细胞移植治疗中枢神经系统损伤后神经功能障碍的有效性和安全性。方法：2004年10月-2005年5月,应用自体骨髓间充质干细胞移植治疗5例中枢神经系统损伤后神经功能障碍患者（脑卒中患者3例,脑外伤术后患者2例）。手术首先抽取自体骨髓细胞悬液,在体外经过分离培养后,制成骨髓间充质干细胞悬液,通过静脉输注方式移植脑内。结果：移植治疗后所有患者均未见不良反应。出院半年后随访,最长随访时间达2年。5例患者神经功能缺损症状较移植前均有很大程度的改善,其中2例神志不清患者神志恢复,可按吩咐动作;4例患者肌力提高1-3个级别;失语症状均得到一定改善。结论：自体骨髓间充质干细胞移植治疗中枢神经系统损伤后神经功能缺损疾病是一种简单、安全、有效的方法,值得进一步开展临床观察和验证。     

骨髓间充质干细胞移植后大鼠脑缺血区微血管密度及VEGFmRNA表达的动态变化

目的探讨骨髓间充质干细胞(MSCs)移植促进大鼠脑缺血后神经功能恢复的可能机制。方法采用线栓法复制大鼠脑缺血2小时再灌注动物模型,实验动物分缺血对照组和移植治疗组,再灌注24小时后移植治疗组经颈动脉移植体外培养异体骨髓间充质干细胞。于移植后1周、2周、4周、12周分批处死实验动物,采用免疫组织化学染色及原位杂交技术观察缺血区脑组织的新生血管及VEGFmRNA表达的动态变化。结果①大鼠脑缺血后1周时缺血区皮层即可见大量的微血管增生,2周时达到高峰,4周、12周时有所下降。1周、2周、4周、12周时移植组比对照组缺血区皮层微血管密度(MVD)明显增高,P<0.05;②大鼠脑缺血后1周及2周时缺血区脑组织中均可见大量的VEGFmRNA阳性细胞,阳性信号主要分布于皮层及血管周围的神经细胞,缺血后4周及12周对照组VEGFmRNA阳性信号很弱,而移植组VEGFmRNA阳性信号仍较强。结论MSCs可能通过促进微血管增生改善缺血区血运修复缺血区损伤组织,从而改善脑缺血大鼠神经功能。     

无精症或严重少精症患者Y染色体微缺失的检测

目的探讨不育男性无精子症或严重少精子症与Y染色体微缺失之间的关系。方法利用多重PCR法检测无精子症或严重少精子症患者的Y染色体微缺失情况。结果52例无精子症或严重少精子症患者中共检出Y染色体微缺失4例,缺失率为7.69%。精液正常者（对照组）12例未发现Y染色体微缺失。4例Y染色体微缺失的无精子症患者睾丸细胞学检查均未发现精子。结论Y染色体微缺失是造成男性精子发生障碍的常见病因之一。     

LPS刺激后小鼠巨噬细胞Toll样受体(TLR)4及肿瘤坏死因子α表达的变化

革兰阴性菌败血症休克的发生主要是因为免疫系统对细菌LPS应答,产生过量细胞因子和炎性介质从而引起组织和器官损害。研究发现与果蝇Toll蛋白类似的哺乳动物Toll样受体家族在宿主防御中起重要作用,其中TLR4介导针对LPS的免疫应答。它们对病原体的保守结构产生应答并且激活单核细胞和中性粒细胞产生细胞因子和炎性介质。本研究观察LPS刺激后体外培养的小鼠腹腔巨噬细胞表面TLR4表达及最重要的炎性细胞因子之一的肿瘤坏死因子α分泌水平的变化。方法常规方法从BALB/C小鼠腹腔中分离出巨噬细胞（Mφ）,细胞分为6组,分别加入LPS使其终浓度为0、0.001、0.01、0.1、1、10μg/ml,5%CO2,37℃孵育2h。流式细胞术测定Mφ表面TLR4的表达。同时取培养液上清采用ELISA方法检测TNFα。实验重复三次。结果①经0.01μg/mlLPS刺激的MφTLR4-PE阳性率与0μg/mlLPS组相比,P〈0.05。其它浓度刺激组TLR4阳性率则与对照组无差异,P〉0.05。Mφ细胞TLR4MFI随着LPS浓度的升高而增强,除了10μg/mlLPS组,其余各组MFI与对照组相比,P〈0.05。②随着LPS浓度增加,TNFα分泌量逐渐升高,呈剂量依赖关系。但当LPS浓度达10μg/ml时,TNFα分泌量下降。结论LPS能够诱导Mφ胞膜表面TLR4表达和TNFα分泌升高,并且在一定浓度范围内呈量-效关系.