HPVl8 E7联合SLC基因疫苗的构建及在真核细胞中的表达

目的：构建人乳头瘤病毒（human papilloma virus，HPV）18型E7联合小鼠次级淋巴组织趋化因子（Secondary lymphoid tissue chemokine，SLC）真核共表达基因，以获得高效性治疗HPVl8感染及相关肿瘤的DNA疫苗。方法：分别以HPVl8型的中国野毒株、pDsRed2-N1-SLC为模板，利用PCR克隆技术制备HPVl8E7和SLC基因，分别双酶切后胶回收获得HPVl8E7、SLC基因片段，分别插入到真核表达载体pIRES的多克隆位点B（MCSB）和多克隆位点A（MCSA）中，构建pIRES-E7-SLC真核共表达质粒。酶切及核酸序列分析鉴定质粒。脂质体转染人脐静脉内皮细胞（ECV）细胞，以Western bolt方法鉴定真核表达质粒E7的表达，用ELISA的方法鉴定真核表达质粒SLC的表达。结果：酶切及核酸序列测定表明真核表达质粒pIRES-E7-SIC的成功构建。RT-PCR和Western-Blotting方法证实E7及SLC蛋白在真核细胞的正确表达。结论：成功地构建真核表达质粒plRES-E7-SLC，用它转染ECV细胞后，能表达E7和SLC蛋白，为下一步研究HPVl8感染及相关肿瘤疫苗奠定了基础。     

乙型肝炎病毒感染者血清前S_1和前S_2抗原同步检测的临床意义

采用 ELISA 双抗体夹心法对106例 HBV 感染者共146份血清进行前 S1和前 S2抗原同步检测,结果血清前 S 抗原与血清 HBVDNA 密切相关,但并不完全一致;其与血清 HBeAg、PHSA 受体活性及抗 HBc 也具有良好的正相关性。五组不同临床类型 HBV 感染者血清前 S 抗原检出率及相对含量均以 ASC 组最高,SH 组次之,CAH、CPH 和 AH 组均较低。AH 组随疾病恢复、ALT 下降,血清前 S 抗原相对含量下降乃至阴转;CAH 和 CPH 组尽管病情改善、ALT 下降,血清前 S 抗原相对含量并无明显改变;SH 组则无论病情好转或恶化,血清前 S 抗原相对含量均下降。表明连续定量检测血清前 S 抗原可为除 SH 外其它各型乙型肝炎提示预后。作为 HBV 复制和疾病预后观察指标血清前 S1抗原较前 S2抗原敏感。     

钙网蛋白在肿瘤基因治疗中的应用

钙网蛋白(calreticulin,CRT)是热休克蛋白家族成员之一,为哺乳动物体内高度保守的、大小约为46kDa的Ca2 结合蛋白。人的CRT基因定位于第19号染色体的p13.3~p13.2,主要存在于内质网(endoplasmic reticulum,ER)和细胞膜表面。CRT功能相对比较保守,最近研究人员利用其某些功能将CR     

细胞膜穿透肽及其在肿瘤治疗中的应用

穿透细胞膜进入细胞内是许多作用靶点在细胞内的生物大分子发挥作用的先决条件,然而生物膜的生物屏障作用阻止了许多高分子物质进入细胞内,从而很大程度地限制了这些物质的在治疗领域的应用.因此,如何引导这些物质穿透细胞膜是一个迫切需要解决的问题.     

转化生长因子β/骨形成蛋白应答元件表达质粒的构建及功能检测

目的:为了确认与转化生长因子β/骨形成蛋白(TGF-β/BMP)信号通路相关的转录因子,建立靶向治疗肝纤维化的筛选平台.方法:通过分子生物学技术设计、合成TGF-β/BMP应答元件(TRE/BRE),构建真核表达质粒pGLuc-TRE-MiniTK、pGLuc(BRE)2-MiniTK和pGLuc(GCCG) 9-MiniTK.通过脂质体将pGLuc-TRE-MiniTK转染到小鼠成纤维细胞L929内,并采用TGF-β的持续活化型受体CA-ALK5激活TGF-β信号;将p-GLuc(BRE)2-MiniTK和pGLuc-(GCCG)9-MiniTK分别转染到大鼠肝星状细胞HSC-T6内,用BMP的持续活化型受体CA-ALK3激活BMP信号.然后,通过荧光检测培养细胞上清中的GLuc表达量,以此确认TGF-β/BMP应答元件的功能.结果:酶切鉴定和测序分析证实TRE、(BRE)2及(GCCG)9的碱基序列、插入方向和阅读框架正确.荧光素酶检测显示TRE和(BRE)2的荧光素酶GLuc大量表达,而(GCCG)9的荧光素酶GLuc表达不理想.结论:真核表达质粒pGLuc-TRE-MiniTK和pGLuc-(BRE) 2-MiniTK具备筛选与TGF-β/BMP信号通路相关转录因子的功能.     

聚乙烯吡咯烷酮预处理培养细胞促进TAT穿膜效率

目的:探讨PVP预处理细胞对TAT穿膜效率的影响及其作为促渗剂的安全性,以优化TAT穿膜条件。方法:人工合成荧光标记短肽TAT-FITC和作为阴性对照的无意义肽NCO-FITC作用于PVP预处理各种细胞株,荧光显微镜观察TAT-FITC的穿膜效率及其定位;荧光酶标仪定量检测不同预处理的各种细胞摄取荧光标记短肽;MTT检测PVP对各种细胞的存活率及溶血实验检测其对细胞膜结构完整性的影响。结果:经PVP预处理细胞后,TAT-FITC可有效穿膜进入细胞内,MTT结果显示适当浓度的PVP对细胞活力几乎没有影响;溶血实验也证实,PVP不影响红细胞的细胞膜完整性。结论:本实验观察显示,PVP可以明显提高TAT对培养细胞的穿膜效率,但对细胞活力影响很小。     

人乳头瘤病毒18型E2蛋白抗体制备及鉴定

[摘要] 目的 研究人乳头瘤病毒(Human papillomavirus,HPV)18型E2蛋白的生物学活性,制备人乳头瘤病毒18型E2 蛋白特异性抗体。方法 使用原核表达载体pET28a (+)中表达,镍螯合亲和层析胶体纯化的全长HPV18E2蛋白免疫日本大耳白兔,制备多克隆抗体。通过酶联免疫吸附实验（ELISA）,Western Blot法和免疫组织化学法检测抗体特异性。结果 ELISA法检测显示：抗E2抗血清稀释滴度可达1:10000以上,并能通过Western Blot法和免疫组织化学法检测到真核细胞表达的HPV18E2蛋白,提示具有较高抗体滴度和较强特异性。结论 以原核表达系统表达并纯化的全长HPV18E2蛋白免疫日本大耳白兔,制备得到多克隆抗体能够检测真核细胞表达的E2蛋白,为进一步研究HPV18E2提供了有用的工具。