HIV-1 Tat基因在pEGx-KG中的融合构建及原核表达

目的:在大肠杆菌BL21(DE3)中高效表达融合的Tat蛋白。方法:用PCR方法从HIV cDNA文库中扩增出Tat基因,并将其插入到表达载体pEGx-KG中,转化到E.coli中进行融合表达,表达产物用蛋白电泳和Western-blot进行鉴定。结果:成功地构建了重组质粒pEGx-KG-Tat,重组质粒在大肠杆菌BL21(DE3)中得到高效表达。蛋白电泳和Western-blot分析表明,在相对分子质量(Mr)为38.9kDa处有1条特异性的带。结论:GST基因与HIV-1 Tat基因的融合构建,使Tat蛋白在大肠杆菌中得到高效表达,为艾滋病的防治研究奠定了基础。     

Ag43／GFP 嵌合表达质粒的构建及其在大肠杆菌表面的表达

目的：构建大肠杆菌抗原Ag43（pETAg43′）以及Ag43和绿色荧光蛋白（GFP）（pETAg43′／GFP）的重组表达质粒,了解pETAg43′／GFP是否能够将GFP表达于细菌表面。方法用PCR扩增获得Ag43大部分基因序列（ Ag43′）,同时用酶切方法从质粒pEGFP－C1切取GFP基因序列,首先将Ag43′基因序列插入表达质粒pET－22b中,获得重组质粒pETAg43′,然后再将GFP基因序列插入pETAg43′获得质粒pETAg43′／GFP。将重组质粒pETAg43′／GFP转化Ag43基因缺失的菌株JM109（△Ag43）,用荧光显微镜和SDS－PAGE了解是否能将GFP表达于细菌表面,同时了解加热是否能够直接获得Ag43′／GFP的嵌合重组蛋白。结果琼脂糖凝胶电泳发现PCR扩增的Ag43′和GFP基因序列分子量大小与预期值相一致,酶切分析重组质粒pETAg43′和pETAg43′／GFP结果与预期值相符,基因测序显示质粒pETAg43′和pETAg43′／GFP的基因序列和阅读框架均准确无误。质粒pETAg43′／GFP经诱导后可以将Ag43′／GFP嵌合蛋白表达于大肠杆菌JM109（△Ag43）的表面,55℃加热50 min是提取Ag43′／GFP嵌合蛋白的最佳条件。结论成功构建了能够将外源蛋白GFP表达于细菌表面的重组表达载体,在大肠杆菌表面有效表达并加热提取获得了嵌合重组蛋白Ag43′／GFP,为制备其他自身抗原分子的Ag43嵌合蛋白奠定了基础。     

小鼠IL-5真核表达质粒的构建和体外表达

目的 构建小鼠白细胞介素-5（IL-5）基因真核表达质粒,了解该质粒在真核细胞COS细胞中有效表达情况.方法 以含有小鼠IL-5基因的克隆质粒pORF9-mIL-5为模板,通过PCR扩增小鼠IL-5全段基因,应用基因工程技术将扩增的基因片段插入peDNA3.1（＋）真核表达质粒,构建重组真核表达质粒pcDNA-m IL-5,经限制性内切酶酶切分析及测序鉴定正确后,用脂质体转染技术转染COS细胞,用Western Blot鉴定该质粒是否能够在真核细胞中表达相应的目的蛋白质.结果 成功扩增了小鼠IL-5全长基因,酶切和测序证明正确构建了重组真核表达质粒pcDNA-m IL-5,Westem blot方法证实该质粒能在COS真核细胞中有效表达小鼠IL-5目的蛋白.结论 成功构建了小鼠IL-5基因的真核表达质粒载体,为进一步研究IL-5的新功能和免疫基因治疗奠定了基础.