结核病分子流行病学研究方法进展和探讨

结核病分子流行病学在结核病的控制方面有着良好的应用前景,发达国家已将其列入常规检查,在我国也有很好的应用前景和更大的应用空间.目前的基因分型的主流方法仍然是采用数目可变串联重复序列(VNTR)和间隔区寡核苷酸分型共同应用的模式.间隔区寡核苷酸分型是继IS6110限制性片段长度多态性(RFLP)之后应用于结核分枝杆菌基因分型最广泛的方法之一,目前被作为鉴定北京基因型菌株的标准方法.VNTR方法操作简便、快速,成本低廉,重复性好,便于不同实验室间相互比较;VNTR方法选用的位点在不同国家和地区会有不同,VNTR位点分辨率的高低也需要深入研究.IS6110-RFLP方法虽然已经不再大规模地使用,但是一直作为鉴定其他基因分型方法的正确率和准确度的金标准.随着分子生物学技术的进步,基因分型技术出现新的发展趋势.如长片段多态性(LSP)和单核苷酸多态性(SNP)方法是近几年出现的频率越来越高的分型方法.目前LSP和SNP方法的分辨率虽然不高,但在研究系统发育中确有很好的应用.系统发育学的研究一开始是采用VNTR-15和VNTR-24的方法,后来发现存在不确定性且误差较大,随着对LSP和SNP特性的了解更加全面,认为LSP和SNP是研究系统发育学的最好的方法.随着分子生物学技术的不断进步,结核病分子流行病学的研究将会为结核病的预防和控制提供更多支持和指导.     

中国汉族人群TIRAP基因编码区多态性与结核病易感性的相关性研究

目的 筛选中国汉族人群Toll/白细胞介素1受体结构域衔接蛋白(TIRAP)基因编码区多态性位点,并分析其与结核病易感性的相关性.方法 在小样本中测序筛选TIRAP基因编码区多态性位点,再用连接酶特异检测技术在大样本中进行单核苷酸多态性(SNP)分型,并通过统计学方法分析基因多态性与结核病易感性的相关性.结果 共筛选到4个TIRAP基因编码区多态性位点.G394A位点在结核病病人中的突变频率高于健康人,但是该位点等位基因频率在两组人群中的差异没有统计学意义(P>0.05).G164A位点跟结核病病情有关,复治病人与健康人该位点等位基因差异具有统计学意义(P<0.05),同时肺部形成空洞病人与菌阳病人突变率均比健康人要低.结论 TIRAP 基因编码区多态性可能是中国汉族人群结核病发生发展的危险因素.

Abstract：

Objective To detect specific polymorphisms in Toll-interleukin 1 receptor domain containing adaptor protein(TIRAP) coding region for Chinese Han population, and verify whether they are associated with susceptibility to tuberculosis. Methods Search TIRAP polymorphisms by sequencing in small sample; detect single nucleotide polymorphism(SNP) by ligase detection reaction technique in large sample; analyze whether polymorphisms are related to tuberculosis by statistic methods. Results Four polymorphisms were present in the TIRAP coding region. 394A had higher frequencies in the tuberculosis(TB)group than the control. But allelic and genotypic analysis showed that there were no significant difference in statistic between TB patients and controls(P>0.05). The SNP G164A mutation related with TB patient's condition. Comparing to controls, retreatment patients' allelic frequencies had significant difference in statistic(P<0.05), sputum positive patients and lung cavitation patients had lower 164A frequencies. Conclusion TIRAP coding region polymorphisms may be risk factors for TB occurrence and development in Chinese Han population.     

结核分枝杆菌肝素结合血凝素在结核病免疫应答中的研究

Objective To investigate the immune protection of heparin-hinding hemagglutinin ad-hesin(HBHA) and to estimate its potential diagnostic value. Methods Native HBHA were used to stimu-late peripheral blood mononuelear cells (PBMCs) from different infected-cases including PPD negative healthy control, PPD positive latent tuberculosis(LTB) infection, pulmonary tuberculosis, and the IFN-γ/in the supernatant of culture was detected. Meanwhile, HBHA specific IgG antibody in the sera was detected by ELISA. Results The middle level of HBHA specific IFN-γ of the three groups were 49.5 pg/ml, 781.9 pg/ml and 341.8 pg/ml, respectively. IFN-γ of latent tuberculosis group was much higher than that of the control, and slightly higher than that of the patients with pulmonary tuberculosis. And the absorbency of the IgG antibody to HBHA in the three groups was 0.212±0.066, 0.224 ± 0.076 and 0.285±0.078. lgG an-tibody in the patients with pulmonary tuberculosis is higher than that of the healthy, including the control and the latent tuberculosis infection. Conclusion HBHA has good immunogenieity, and it can stimulate the LTB to release high level IFN-γ, suggests that the LTB doesn't develop active tuberculosis may rely on its protection. HBHA specific. IFN-γ release may identify 1,333 from the healthy. Anti-HBHA antibody plays an auxiliary role in the diagnosis of pulmonary tuberculosis.     

Ra1362调控环二鸟苷酸影响结核分枝杆菌H37Ra的生物膜发育和休眠

通过敲除环二鸟苷酸(c-di-GMP)合成酶基因Ra1362探讨该基因在结核分枝杆菌(MTB) H37Ra株生物膜发育和休眠中的作用。     

细菌whi基因及其在分枝杆菌中的特点和功能

whi基因是根据链霉菌中形成白色孢子突变体的相关基因来命名的。目前发现的whi基因分别为除whiC基因和whiF外的whiA～O中的13种基因。存在whi基因的细菌种类已经在链霉菌和分枝杆菌等17种细菌属中发现。目前对两者的研究资料较少,而研究较多的是whiB家族,其中whiB2、whiB3和whiB7具有重要的临床意义。该文对现阶段严重威胁人类健康的致病分枝杆菌属中存在的whi基因(whiA、whiD和whiB)其功能与特点进行讨论。     

卡介苗菌MDP1基因敲除技术的研究

目的　在卡介苗中建立基因敲除技术。方法　通过分别设计两对引物 ,将靶基因[DNA结合蛋白 1(MDP1)基因 ]通过聚合酶链反应 (PCR)的方法扩增得到 2个片段 ,分别插入pKO质粒中 ,构建得到基因敲除质粒pKO MDP1,电转入至卡介苗菌株细胞内并与BCG基因组中的MDP1基因同源交换 ,筛选出敲除菌株 ,并测其生长曲线。结果　通过 2次PCR筛选和 1次蔗糖反筛选后得到的、并在含潮霉素培养基上不能生长的菌株为MDP1基因敲除菌株 ,对敲除菌株与原代菌株每 12h测定其菌液的 6 0 0nm处吸光度 (A60 0 )值 ,连续 16d。两者的生长速度曲线呈现“S”形 ,两者之间的生长速度未见明显差别。结论　pKO质粒可作为基因敲除有用的质粒载体 ,MDP1基因可能是影响BCG生长的因素之一 ,但不是惟一的因素     

卡介苗菌MDP1基因敲除技术的研究

目的 在卡介苗中建立基因敲除技术。方法 通过分别设计两绔引物，将靶基因[DNA结合蛋白1(MDP1)基因]通过聚合酶链反应(PCR)的方法扩增得到2个片段，分别插入pKO质粒中，构建得到基因敲除质粒pKO-MDPI，电转入至卡介苗菌株细胞内并与BCG基因组中的MDP1基因同源交换，筛选出敲除菌株，并测其生长曲线。结果 通过2次PCR筛选和1次蔗糖反筛选后得到的，并在含潮霉素培养基上不能生长的菌株为MDP1基因敲除菌株，对敲除菌株与原代菌株每12h测定其菌液的60hm处吸光度(A600)值，连续16d。两者的生长速度曲线呈现“S”形，两者之间的生长速度未见明显差别。结论 pKO质粒可作为基因敲除有用的质粒载体，MDP1基因可能是影响BCG生长的因素之一，但不是惟一的因素。     

以PCR为基础的结核分枝杆菌DNA分型技术及其应用

1998年结核分枝杆菌标准菌株H37Rv基因组测序工作宣告完成，这就为建立分子生物学方法鉴定结核分枝杆菌并对其分型提供了更有力的依据。H37Rv整个基因组由4，411，529对碱基组成，含有约4，000个基因，整个基因组内有56个区与插入序列(ISs)同源。