丙型肝炎病毒F蛋白反式激活基因2的克隆化研究

目的:应用抑制性消减杂交(SSH)技术及生物信息学(bioinformatics)技术筛选并克隆丙型肝炎病毒(HCV)F蛋白反式激活新型靶基因,进一步阐明HCV感染相关疾病的发病机制.方法:以HCV F蛋白表达质粒pcDNA3.1(-)-F转染HepG2细胞,以空载体pcDNA3.1(-)为平行对照,提取mRNA并进行抑制性消减杂交分析.应用分子生物学技术,结合生物信息学技术,克隆HCV F蛋白反式激活作用的新的靶基因.结果:对于所获基因片段序列分析表明,其中之一为新型基因片段.从HepG2细胞提取总RNA,以逆转录多聚酶链反应(RT-PCR)技术扩增获得该新基因的全长序列,并测序证实,因其可以被F蛋白反式激活,故命名为F蛋白反式激活蛋白2(HCV FTP2),已在GenBank中注册,注册号:AY740522.HCV FTP2基因的编码序列全长为177个核苷酸(nt),编码产物由58个氨基酸残基(aa)组成.结论:HCV F蛋白在病毒的自然感染过程中有明显的表达,最近的研究表明蛋白还具有反式激活的作用,上调宿主细胞某些基因的表达,可能参与HCV致癌.HCV F反式激活新靶基因的发现,为进一步研究HCV F蛋白的分子生物学机制和探索新型治疗技术奠定了基础.     

丙型肝炎病毒非结构蛋白NS4B反式激活基因的克隆化研究

目的应用抑制性消减杂交(suppression subtractive hybridization,SSH)技术构建丙型肝炎病毒(HCV)非结构蛋白4B(NS4B)转染细胞差异表达cDNA消减文库,克隆HCV NS4B蛋白反式激活相关基因.方法以HCV NS4B表达质粒pcDNA3.1(-)-NS4B转染HepG2细胞,以空载体pcDNA3.1(-)为对照,制备转染后的细胞裂解液,提取mRNA并逆转录为cDNA,进行抑制性消减杂交分析.将富集的二次PCR产物与T/A载体连接,并转染大肠杆菌进行文库扩增,随机挑取克隆聚合酶链反应(PCR)扩增后进行测序及同源性分析.结果文库扩增后得到33个阳性克隆,经菌落PCR分析显示其中28个克隆含有大小不等的200～1000 bp插入片段.测序及同源性分析显示,12种已知基因编码蛋白,包括一些与细胞周期、信号传导及肿瘤发生等细胞生长调节密切相关的蛋白编码基因,可能是NS4B反式激活靶基因.结论成功构建了HCV NS4B反式激活基因差异表达的cDNA消减文库,为进一步阐明HCV NS4B反式调节的靶基因在肝炎、肝纤维化和肝细胞癌发生的分子生物学机制提供理论依据.     

钾离子通道β亚单位KCNE4对KCNQ1及HERG电流的影响

目的:研究钾离子通道β亚单位KCNE4对KCNQ1及HERG通道电流的影响。方法: 构建离子通道细胞模型,单独表达基因KCNQ1、HERG,以及联合表达基因KCNQ1+KCNE4、HERG+KCNE4。采用全细胞膜片钳方法记录通道电流曲线,比较组间电流的大小及通道的动力学特征。采用免疫荧光细胞定位方法,检测KCNE4对通道蛋白表达的影响。结果: KCNE4与 KCNQ1共表达显著减低KCNQ1通道电流。单独表达KCNQ1通道的细胞,膜电位+60 mV时,平均电流密度为(24±2.9) pA/pF,共表达KCNQ1+KCNE4时,细胞电流密度降至(7.3±1.1) pA/pF。与KCNQ1电流相比,+40 mV时KCNQ1/KCNE4激活时间常数的快成分(τfast)增加,但慢成分(τslow)减慢,KCNQ1/KCNE4无尾电流产生,表明KCNE4参与了KCNQ1通道动力学的调整。单独表达KCNE4亚单位的细胞没有产生任何电流。当KCNE4与HERG共表达时,电流的大小、电流电压关系曲线及通道稳态激活曲线都与HERG通道无明显差异,电流密度为(26.7±3.9) pA/pF,半数激活电压(V1/2)为(-3.10±0.68) mV,斜率因子为8.89±0.33。从通道的失活时间常数以及失活后恢复时间常数与测试电压的关系曲线可见,KCNE4对HERG通道的动力学特征均无影响。免疫荧光染色结果显示,KCNE4没有影响KCNQ1蛋白的表达。结论: KCNE4亚单位可显著改变KCNQ1通道的电压敏感性,表现出抑制作用,KCNE4对KCNQ1蛋白在细胞膜上的表达及HERG通道电流均无影响。     

小骨窗经外侧裂显微手术治疗对基底节区脑出血患者围术期指标及术后并发症的影响

目的 探讨小骨窗经外侧裂显微手术治疗对基底节区脑出血患者围术期指标及术后并发症的影响.方法 选取2017年5月至2019年5月安徽省芜湖市第五人民医院收治的89例基底节区脑出血患者,根据手术方式分为观察组(小骨窗经外侧裂显微手术,46例)和对照组(骨瓣开颅血肿清除术,43例).比较两组患者围术期指标(手术时间、引流管放...     

中国人群流行的乙型肝炎病毒特异性CTL表位特点分析

目的研究中国人群中流行的乙型肝炎病毒（HBV）基因型B型和C型特异性CTL表位的序列特点。方法以国外文献报道的13个HBV的CTL表位氨基酸序列为参考序列,分析其与GenBank下载的45条及作者从乙型肝炎病人血清中扩增的另外5条B型或C型CTL表位氨基酸序列的差别。结果与参考序列相比,本研究分析的B型和C型HBV特异性CTL表位氨基酸序列变异发生频率较高。在本研究分析的13个表位中,变异发生率超过70％的表位在B型HBV有4个,分别是表位FLLTRILTI（A^＊0201,S183—191）、VLQAGFFLL（A^＊0201,S188-196）、ILSPFLPLL（A^＊0201,S382—390）和FLPSDFFPSV（A^＊0201,C18-27）,C型HBV有2个,分别是表位ILSPFLPLL（A^＊0201,S382—390）和FLPSDFFPSV（A^＊0201,C18-27）。其中文献中研究最多的HBcAg表位18—27（FLPSDFFPSV）,在我国流行的B型和C型HBV中表位的变异率分别高达71％和97％。结论中国人群流行的B型和C型HBV特异性CTL表位与国外文献报道的CTL表位相比在大多数位点上都出现变异,并且不同表位的变异率差异很大,在检测CTL数量和功能时应根据这一特点设计实验。     

黄芩茎叶总黄酮预处理对缺血再灌注心肌脂质过氧化损伤的保护作用

目的：探讨黄芩茎叶总黄酮(SSTF)预处理对缺血再灌注心肌脂质过氧化损伤的保护作用。方法：雄性大鼠分为SSTF预处理组、缺血再灌组和假手术组,缺血再灌术前给SSTF组大鼠SSTF(50、100、200mg·kg~1·d~(-1))灌胃,制备缺血再灌模型,分别测定心肌组织超氧化物歧化酶(SOD)活性和丙二醛(MDA)含量,血清乳酸脱氢酶(LDH)、肌酸激酶(CK)水平。结果：SSTF预处理可不同程度显著降低缺血再灌注引起的MDA含量,提高SOD活性,降低LDH、CK水平。结论：SSTF预处理能通过保护心肌抗氧化酶的活性,抵制脂质过氧化反应,减轻自由基对心肌的损害,对缺血再灌注心肌产生保护作用。     

CD4+CD25+T细胞对NK细胞活性的影响

目的 初步探讨CD4 CD25 T细胞对NK细胞杀伤活性的影响,以及TGF-β1分子在其中的作用.方法 磁珠分选纯化BALB/c小鼠脾脏CD4 CD25 T细胞与NK细胞,体外用ConA激活CD4 CD25 T细胞,将激活的CD4 CD25 T细胞与NK细胞共培养,并加入抗TGF-β1抗体,在共培养的24h和48h,用51Cr标记的YAC-1检测NK细胞的杀伤毒性.结果 初始CD4 CD25 T细胞在与NK细胞共培养的24h和48h能够显著抑制NK细胞活性,其抑制率分别为50.8%和49.1%,加入抗TGF-β1抗体后,抑制率变为:-0.1%、0.25%;ConA激活的CD4 CD25 T细胞在与NK细胞共培养的24h和48h也能显著抑制NK细胞活性,其抑制率分别为19%和20.9%,加入抗TGF-β1抗体后,抑制率变为25.2%、16.3%.结论 TGF-β1参与了CD4 CD25 T细胞对NK细胞毒性的抑制,并且,其在CD4 CD25 T细胞激活、不激活状态下的影响结果不同.     

百合固金汤联合TP化疗方案对晚期肺肾阴虚型非小细胞肺癌患者肿瘤标志物及NF-κB、MMP-2、MMP-9水平的影响

目的 探讨百合固金汤联合TP化疗方案治疗晚期肺肾阴虚型非小细胞肺癌(NSCLC)的临床效果。方法 将我院80例晚期肺肾阴虚型NSCLC患者根据随机数字表法分为对照组(n=40,常规TP化疗方案)与观察组(n=40,在对照组基础上给予百合固金汤)。比较两组的治疗效果。结果 治疗8周后,观察组的白细胞分化抗原4阳性(CD4⁺)、白细胞分化抗原4阳性/白细胞分化抗原8阳性(CD4⁺/CD8⁺)高于对照组,白细胞分化抗原8阳性(CD8⁺)及癌抗原125(CA125)、癌胚抗原(CEA)、细胞角蛋白19片段抗原21-1(CYFRA21-1)、核因子-κB(NF-κB)、基质金属蛋白酶-2(MMP-2)、基质金属蛋白酶-9(MMP-9)水平低于对照组(P<0.05)。结论 百合固金汤联合TP化疗方案治疗晚期肺肾阴虚型NSCLC可降低肿瘤标志物水平,提高患者的免疫功能,抑制炎症反应。     

HCV NS5A结合蛋白顺乌头酸酶1的验证研究

目的筛选人肝脏cDNA文库中与HCV NS5A的结合蛋白基因,验证其中顺乌头酸酶1与HCV NS5A的相互作用。方法应用酵母双杂交系统3筛选人肝脏cDNA文库中的HCV NS5A结合蛋白基因,应用哺乳动物双杂交及免疫共沉淀技术验证其中顺乌头酸酶1蛋白与HCV NS5A之间的相互作用。结果成功筛选出人肝脏cD-NA文库中与HCV NS5A存在相互作用的蛋白基因,哺乳动物双杂交及免疫共沉淀实验结果证实HCV NS5A与顺乌头酸酶1蛋白在HepG2细胞内存在相互作用。结论本实验成功筛选人肝脏cDNA文库中的HCV NS5A结合蛋白基因,并且在体外水平即细胞内证实HCV NS5A与其中的顺乌头酸酶1蛋白之间的相互作用,为进一步细胞内及体内的糖、脂类代谢等功能研究奠定基础。     

解读2011年美国肝脏病学会关于基因1型慢性丙型肝炎治疗指南的更新

慢性丙型肝炎病毒（HCV）感染的标准抗病毒治疗方案是聚乙二醇化干扰素-α（Peg-IFN-α）2a或Peg-IFN-α2b联合利巴韦林（RBV）治疗。基因1型慢性丙型肝炎初治患者48周持续病毒学应答（sustained virologic response,SVR）为40％～54％,