双向差速法制备高纯度雪旺细胞的实验研究

[目的]利用乳鼠的雪旺细胞与成纤维细胞贴壁及复合酶消化分离速度不同的特点,建立简单而快速提取和纯化雪旺细胞的方法。[方法]取3 d SD大鼠双侧坐骨神经,在解剖镜下剥离去除神经外膜,剪碎后用0.2%复合胶原酶(Collagenase NB4)消化,细胞悬液接种于预先用多聚赖氨酸包被的培养瓶差速贴壁30 min,然后将细胞悬液移入一新的培养瓶培养48 h;用0.05%复合胶原酶37℃消化30 min,振荡分离雪旺细胞与成纤维细胞,培养48 h后在相差显微镜下观察细胞形态;计数、纯度测定;免疫细胞化学鉴定和流式细胞仪检测所得的雪旺细胞的纯度。[结果]经过2次纯化后,每25 cm2培养瓶可获取约(117.2±3.4)×104个细胞;第一轮纯化后雪旺细胞纯度达86.99%±1.53%,经2次纯化后纯度为98.32%±0.12%,两轮纯化之间有显著性差异,P<0.001;P75NTR免疫细胞化学鉴定细胞为阳性,流式细胞仪检测雪旺细胞纯度达97.9%。[结论]双向差速复合胶原酶消化法是一种高效、快捷的雪旺细胞纯化方法。     

骨内微血管和骨的同步三维显像及定量评价

[目的]评价基于显微CT(Micro-CT)骨内微血管造影进行骨内微血管显影和三维重建在缺血性股骨头坏死(osteonecrosis of femoral head,ONFH)研究中的应用价值,实现在三维空间内同时定量评价骨显微结构及骨矿物量和骨内微血管。[方法]采用局部液氮冷冻和射频加热交替的方法建立鸸鹋塌陷性股骨头坏死动物模型,右侧为手术侧,左侧为对照侧。术后定期进行核磁检查,证实造模成功后自鸸鹋腹主动脉注入亚纳米级硫酸钡明胶混悬液进行下肢血管造影,取下肢股骨标本进行Micro-CT扫描,通过软件进行骨内微血管的二维及三维重建,同时结合Micro-CT骨显微结构研究,并将标本常规HE染色进行组织学检查。[结果]在术后12周证实出现股骨头塌陷,至16周16只动物出现股骨头塌陷。Micro-CT图像骨小梁结构及骨内血管显示清晰,与对照侧相比鸸鹋股骨头坏死塌陷后股骨头部的骨小梁厚度、骨体积分数增加,骨矿物量及骨小梁间距减小,血管体积分数减小,且差异均具有统计学意义。[结论]以亚纳米级硫酸钡作为造影剂,Micro-CT骨内微血管造影可以在不破坏骨标本的基础下清晰的显示骨内微血管,不干扰影像及组织学检查,并实现骨内...     

系统细化的出院指导在儿童过敏性紫癜中的应用

目的探索儿童过敏性紫癜系统细化的出院指导。方法将2008年全年收治的首次确诊为过敏性紫癜的患儿320例作为对照组,在患儿出院时对患儿和家属作常规的出院指导。将2009年全年收治的首次确诊为过敏性紫癜的患儿480例作为实验组,在患儿出院时按照新制定的出院手续指导,患儿饮食指导,患儿运动指导,患儿用药指导,患儿保健指导,出院后注意事项,复诊指导的顺序对患儿和家属作系统细化的出院指导。结果对照组患儿随访1年复发60例,家属满意285例,出院指导知晓224例;实验组患儿随访1年复发44例,家属满意470例,出院指导知晓473例。结论系统细化的出院指导对降低患儿复发率有重要作用,且能提高家属满意度,提高家属对疾病预防的认识。     

Micro-CT联合硬膜外造影在医用自交联透明质酸钠凝胶预防椎板切除后硬膜外粘连中的应用

背景：二维平面角度已证实医用自交联透明质酸钠凝胶能够在术后8周有效预防兔椎板切除后硬膜外粘连的发生。 目的：应用Micro-CT联合硬膜外造影技术观察和评估自交联透明质酸钠凝胶预防椎板切除后硬膜外粘连的可行性。 方法：将18只L₅椎板全切除的新西兰大白兔随机分组：对照组用生理盐水冲洗术区后关闭切口;HyaRegen/SPⅠ组用医用自交联透明质酸钠凝胶HyaRegen/SPⅠ 0.5 mL覆盖暴露硬脊膜后关闭切口;HyaRegen/SPⅡ组用医用自交联透明质酸钠凝胶HyaRegen/SPⅡ 0.5 mL覆盖暴露硬脊膜后关闭切口。 结果与结论：各组体感诱发电位潜伏期均无明显延长,3组间差异无显著性意义(P > 0.05)。Micro-CT联合硬膜外造影扫描并三维重建后显示,HyaRegen/SPⅠ组及HyaRegen/SPⅡ组对比剂能够顺利充盈硬膜外间隙,对照组对比剂充盈不顺畅,在术区局部形成多处充盈缺损。HyaRegen/SPⅠ组及HyaRegen/SPⅡ组术区硬脊膜外单位体积内对比剂充盈体积均高于对照组(P < 0.05),前2组间差异无显著性意义(P > 0.05)。对照组硬膜外粘连程度要远高于HyaRegen/SPⅠ组及HyaRegen/SPⅡ组(P < 0.05)。证实医用自交联透明质酸钠凝胶可有效预防兔椎板切除后硬膜外粘连的发生,应用Micro-CT联合硬膜外造影技术能有效观察和评估硬膜外粘连。     

关节软骨细胞外基质源性软骨组织工程取向支架的制备

背景:仿生天然软骨细胞外基质特殊的力学、结构特性和生化成分的软骨组织工程支架具有巨大的应用潜能.目的:观察仿生天然关节软骨细胞外基质的生化和结构特性,探讨关节软骨细胞外基质材料及软骨组织工程取向支架的制备方法,并对其理化性质进行检测.设计、时间及地点:组织工程材料支架制备及性能分析的体外实验,于2007-07/2008-07在解放军总医院骨科研究所完成.材料:将新鲜猪关节软骨湿法粉碎,差速离心,收集无细胞的软骨细胞外基质成分.脱氧核糖核酸酶、核糖核酸酶及碳化二亚胺、N-羟基琥珀酰亚胺均为美国Sigma公司产品.方法:对关节软骨细胞外基质材料进行组织学和形态学榆测后,用pH3.2的稀盐酸制成质量浓度为20 g/L溶液,采用定向结晶及冷冻干燥技术制成关节软骨细胞外基质源性取向支架,再采用物理化学方法交联,同时制各多孔软骨细胞外基质源性非取向支架a主要观察指标:①关节软骨细胞外基质材料的生化组成和形态.②软骨细胞外基质取向支架和非取向支架的表面特征及孔道结构.⑧取向和非取向软骨细胞外基质支架的孔隙率、吸水膨胀率、力学特性的比较.结果:收集的关节软骨细胞外基质材料中无细胞存在,纤维为纳米尺度,甲苯胺蓝、番红花O、奥新蓝染色及Ⅱ犁胶原染色阳性;制备的取向支架具有纵向排列的孔道结构,孔径100-200μ m,分布均匀,非取向支架的孔呈海绵样结构:两种支架孔隙率均≥95%,吸水膨胀率均≥96%.取向支架纵向压缩模量和拉伸模量为:(2.02±0.02),(22.10±0.67)MPa,均大于非取向支架.差异具有统计学意义(P<0.05).结论:天然关节软骨细胞外基质材料与天然关节软骨的生物力学特性相似,可满足软骨组织工程的需要,是一种比较理想的软骨组织工程支架.     

应用于现代战创伤的急救止血剂

据统计,战伤死亡的人群中约有50％是死于不可控制的出血;在和平时期,出血也是创伤致死的第二大原因.即便最终控制了出血,如果不够及时,也会导致出现低体温、凝血功能障碍、感染、酸中毒以及多器官功能衰竭等多种严重并发症而危及伤者生命.因此,及时有效地控制出血,不论对于平时还是战时都意义重大.尽管许多肢体的出血可以通过上止血带来控制,但仍有许多特殊部位的出血,如胸腹部、腋窝、腹股沟等无法使用止血带.通常这些部位的出血改用纱布填塞的方法来压迫止血,但往往效果不佳[1].鉴于此,许多急救止血剂应运而生,旨在压迫止血的同时触发凝血的瀑布级联反应,从而更有效地止血[2].本文将针对目前应用的几种主要急救止血剂的特点、应用、存在的不足及可能的改进方向进行综述.     

锶盐预防创伤性股骨头坏死塌陷作用的初步研究

[目的]观察氯化锶用于预防股骨头坏死塌陷的作用效果及作用机制。[方法]雄性SD大鼠24只,分为3组:假手术组,安慰剂组和氯化锶治疗组。假手术组为正常对照组,安慰剂组在建立股骨头坏死模型后给予生理盐水治疗,氯化锶治疗组在建立股骨头坏死模型后给予氯化锶治疗。术后5周处死,取术侧股骨分别行X线片、Micro-CT和组织学检查。[结果]X线片检查显示股骨头高度与宽度比值安慰剂组<氯化锶治疗组<假手术组,且两两比较均有统计学差异。Micro-CT检查比较三组间股骨头的体积、股骨头内骨量、股骨头骨矿盐含量治疗组和假手术组相比无统计学差异,但都大于安慰剂组。组织学检查显示氯化锶治疗组股骨头内存在坏死骨,与安慰剂组相比,破骨细胞活动减低,而成骨细胞以及血管新生均较活跃。[结论]锶盐可以实现促进成骨和抑制破骨的双重调节,在大鼠创伤性骨坏死模型中具有一定程度预防股骨头坏死塌陷的作用。     

快速成型骨组织工程支架的结构及力学仿生性能特征

目的:利用显微CT的成像技术及材料力学测试,观察多孔双相磷酸钙陶瓷支架的三维结构和力学仿生性能特征。方法:实验于2004-06/2005-12在清华大学新型陶瓷与精细工艺国家重点实验室、香港中文大学威尔士亲王医院骨与关节肌肉研究室和解放军总医院骨科研究所完成。利用三维凝胶叠层成型技术和发泡法复合的方法,制备仿骨多孔双相磷酸钙陶瓷支架,经显微CT扫描得到分辨率为20μm的断层图像,并按骨形态计量方法计算三维计量参数,并与急性脑死亡年轻人股骨头(由解放军总医院骨组织库提供,已签署捐献同意书)标本负重区松质骨样本的三维参数进行统计比较。最后对双相磷酸钙陶瓷支架两个互相垂直方向和松质骨样本的长轴方向进行压缩强度试验,计算压缩强度和弹性模量,并进行统计分析。结果:①双相磷酸钙陶瓷支架的小梁平均宽度和间距低于松质骨小梁(P<0.05);支架的小梁数目和各项异性程度高于松质骨样本(P<0.05);说明支架小梁在排列上呈现更为明显的各向异性特征。②双相磷酸钙陶瓷支架的体积分数、表面积体积比及结构模型指数与松质骨样本相比差异无显著性(P>0.05),两组样本均呈明显的板层结构。③力学测试结果显示双相磷酸钙陶瓷支架材料长轴方向的强度和弹性模量高于垂直方向(P<0.05),说明支架材料具有明显的方向性。长轴方向的强度低于正常松质骨样本,但弹性模量仅比松质骨样本弹性模量高20%(P<0.05)。结论:支架材料在空隙率和表面积方面具有很好的仿生性,利于细胞的黏附和长入。同时具有明显的方向性,提高了其在排列方向上的强度。弹性模量接近股骨头松质骨,具有较好的应力顺应性。     

人脐带Wharton胶中间充质干细胞体外无支架组织工程软骨的构建

背景:构建组织工程软骨的方法多为自体种子细胞复合天然或合成物支架,目前多存在种子细胞来源有限、支架安全性和生物相容性、以及细胞在支架中分布不均的问题.目的:探讨人脐带Wharton胶中间充质干细胞向软骨诱导分化并体外构建无支架组织工程软骨的可行性.方法:分离培养人脐带Wharton胶中的间充质干细胞,进行流式细胞学鉴定.对软骨诱导前后的细胞进行组织学和免疫组织化学染色,对其表达的葡萄糖胺聚糖和Ⅱ型胶原进行定量研究,并应用RT-PCR检测软骨诱导前后Ⅱ型胶原和Sox-9mRNA的表达.采用密集诱导培养→离心管培养→生物反应器培养,进行体外构建无支架软骨组织.结果与结论:人脐带Wharton胶富含干细胞,流式细胞仪检测结果显示这些细胞不表达造血干细胞标志,表达CD44,CD105、CD271等间充质干细胞表面标志;HLA-ABC阳性表达,HLA-DPDQDR阴性表达.未进行软骨诱导的细胞弱表达软骨细胞标志,诱导后葡萄糖胺聚糖和Ⅱ型胶原显著增高.RT-PCR结果显示人脐带Wharton胶间充质干细胞诱导前后均表达Sox-9、Ⅱ型胶原mRNA.说明人脐带Wharton胶间充质干细胞具有前软骨细胞的特性.采用密集诱导培养结合生物反应器培养,不用支架,体外可以构建成大块组织工一[程软骨.表明人脐带Wharton胶间充质干细胞是一种良好的构建组织工程软骨的种子细胞.