弓形虫重组耻垢分枝杆菌M.S-P30-ROP2载体活疫苗构建及鉴定

目的构建和鉴定弓形虫1330-ROP2复合基因重组耻垢分枝杆菌M．s载体活疫苗。方法用亚克隆技术把P30-ROP2复合基因克隆入大肠杆菌／分枝杆菌穿梭质粒pSTM3，构建重组质粒pSTM3-P30-ROP2，电穿孔法导入耻垢分枝杆菌中，潮霉素筛选、PCR法鉴定阳性转化子，温度诱导表达鉴定。结果获得pSTM3-P30-ROP2重组穿梭表达载体，SDS—PAGE结果显示P30-ROP2复合基因表迭蛋白产物分子量约为66kDa。结论成功构建弓形虫复合抗原基因P30-ROP2重组耻垢分枝杆菌疫苗，为弓形虫病的防治提供了-种新方法。     

乙肝表面抗原和弓形虫棒状体分泌抗原多功能真核表达载体的构建与鉴定

目的探讨通过体外扩增乙肝表面抗原(HBsAg)基因,构建真核表达载体pcDNA3-HBsAg-ROP2的可行性。方法根据乙肝S基因序列及pcDNA3-p30-ROP2酶切位点等情况设计、合成引物,应用聚合酶链反应(PCR)技术,扩增HBsAg基因片段;应用回收、纯化、酶切、连接等技术,将HBsAg基因替换pcD-NA3-p30-ROP2中的p30基因,并进行酶切、PCR扩增及测序鉴定。结果 PCR扩增出约0.7 kb的目的基因HBsAg,成功构建pcDNA3-HBsAg-ROP2重组载体。PCR、酶切结果与理论相符,重组体包含了HBsAg和ROP2基因的完整序列。结论利用体外扩增乙肝表面抗原,可成功构建乙肝和弓形虫多功能重组载体pcDNA3-HBsAg-ROP2。     

应用不同抗原作皮内试验诊断华支睾吸虫病的比较观察

在华支睾吸虫病调查中,常用皮内试验作为初筛,为提高试验的特异性和敏感性,我们比较了采用两种不同抗原的皮内试验结果。一、材料与方法(一)华支睾吸虫抗原1.硫酸铵提取抗原:采用前文制备的“C”抗原。2.成虫培养代谢抗原:取华支睾吸虫成虫数条,以生理盐水洗涤,将成虫分装试管内,每管7～8条,加5m11640培养液,37℃培养,每24h 换液一次,15d 后终止培养。将每次换下的培养液超滤浓缩,然后用 PB(pH7.2)透析72h,用生理盐水平衡12h,以18000rpm 离心30min,测蛋白含量为1.05ms/ml,放4℃冰箱保存备用。     

弓形虫ROP2基因的克隆与鉴定

目的 体外扩增弓形虫棒状体分泌抗原2（ROP2）靶基因，构建真核表达载体pc-DNA3-ROP2。 方法 收集、纯化RH株弓形虫速殖子，提取基因组DNA；根据基因库ROP2基因序列设计合成1对引物，应用PCR扩增ROP2基因片段，回收纯化后克隆入TA载体质粒pUCm-T；用限制性内切酶EcoRⅠ、HindⅢ双酶切该重组子，将切下的ROP2基因在T4DNA连接酶作用下插入真核细胞表达载体质粒pc-DNA3，并进一步作双酶切、PCR及测序鉴定。 结果 以弓形虫基因组DNA为模板，PCR扩增出1.7 kb ROP2基因片段，克隆于pUCm-T载体中，再将ROP2基因亚克隆于真核表达载体质粒pc-DNA3，经筛选鉴定，构建pc-DNA3-ROP2重组质粒；测序结果显示，重组质粒包含了ROP2蛋白基因读码框内的完整序列，能完整表达ROP2的抗原蛋白。 结论 弓形虫ROP2基因片段，经TA克隆及亚克隆，构建弓形虫pc-DNA3-ROP2重组质粒。     

弓形虫ROP2核酸疫苗免疫保护作用的研究

目的 研究ROP2核酸疫苗对BALB/c小鼠的免疫保护作用。 方法 42只BALB/c小鼠随机分为3组：实验组、空质粒组和PBS对照组，各组小鼠分别肌注pc-DNA3-ROP2重组质粒50 μg、pc-DNA3空质粒50 μg和PBS 50 μl，共免疫3次，每次间隔3周，末次接种量均加倍。末次免疫后2周，各组分别取4只小鼠的血清、脾和淋巴组织，检测CD4⁺、CD8⁺ 及各细胞因子。其余各组每鼠腹腔攻击感染RH株弓形虫速殖子500个，观察其存活时间等。 结果 ROP2核酸疫苗能诱发小鼠产生细胞免疫和体液免疫反应，小鼠血清抗体滴度高并能识别由基因重组体外诱导表达的ROP2蛋白抗原；实验组小鼠的CD4⁺T细胞增殖明显(69.5±3.4)%、CD4+/CD8+ 比值显著升高(4.69±1.32)%（P<0.01）；其脾、淋巴结细胞培养液及血清中白细胞介素-2（IL-2）、IL-4、IL-6、IL-12、γ干扰素（IFN-γ）和肿瘤坏死因子（TNF）均有不同程度的升高，尤其是血清中升高最为显著。弓形虫攻击感染180 h后，实验组小鼠免疫保护率为88.9%，与对照组相比，小鼠存活时间明显延长、初始死亡时间明显推迟（P<0.01）。 结论 ROP2核酸疫苗具有较强的免疫原性，能产生良好的免疫保护作用。     

编码刚地弓形虫棒状体蛋白2与主要表面抗原1基因的克隆和表达

目的 构建编码弓形虫RH株棒状体蛋白2（ROP2）和主要表面抗原1的重组表达质粒，纯化和复性的融合蛋白为弓形虫病快速诊断试剂盒及蛋白质疫苗的研制作准备。方法 用PCR技术从弓形虫基因组DNA中扩增出ROP2和P30基因片段，分别克隆人pMDl8-T载体，并对重组人外源基因的质粒通过PCR、双酶切和测序鉴定，将pMD-ROP2中RoP2基因片段经EcoRI和HindⅢ酶切、连接等反应，亚克隆入pET-30a（＋）原核表达载体，构建pET-ROP2载体，然后再将pMD-P30中的P30基因片段与经同样NcoI和EcoRI酶切的pET-30a（＋）载体连接，经含卡那霉素的LB平板筛选，酶切和PCR鉴定。阳性重组质粒转化到大肠埃希菌BL21（DE3）中，经IPTG诱导，表达产物用SDS-PAGE进行鉴定。大量的表达融合蛋白经纯化和复性后，用Westernblot分析。结果 从弓形虫RH株DNA中扩增出特异的RoP2和P30基因片段，成功克隆出pET-ROP2和pET-P30载体。结论 成功构建了pET-ROP2和pET-P30重组体，获得纯化和复性的弓形虫ROP2和P30的高效表达产物，为弓形虫病的诊断和疫苗研究奠定了基础。     

三、山东部分地区贾第虫感染情况调查分析

1988年5月～1990年5月,对我省西部的定陶县、北部的阳信县、南部的苍山县、中部的肥城县、东部的莱西县采用卢戈氏碘液直接涂片法进行了贾第虫感染情况的调查。结果五县共粪检11925人份,贾第虫感染者669例,平均感染率为5.6±0.2％。其中定陶为10.5％(221/2 107)、阳信9.7％(252/2 594)、苍山为4.3％     

山东省平原地区农村居民肠道寄生虫感染现状调查

目的 目的 了解山东省平原地区农村居民人体肠道寄生虫感染现状, 分析相关因素。 方法 方法 抽取东营、 潍坊、 济宁和菏泽等4市24个村为研究区, 采用改良加藤氏厚涂片法检查居民粪便标本, 并对 ≤ 12岁儿童以透明胶纸肛拭法检查蛲虫卵。每个调查点随机抽取50户家庭, 就家庭一般情况和家庭成员寄生虫病防控知识、 卫生行为等情况进行问卷调查。 结果 结果 共计调查8 227名常住居民, 并为1 313名儿童检查了蛲虫卵。居民肠道寄生虫总感染率为0.55% （45例）, 其中蛔虫、 钩虫、 鞭虫、 蛲虫和华支睾吸虫感染率分别为0.15% （12例）、 0.06% （5例）、 0.09% （7例）、 1.37% （18例） 和0.04% （3 例）。共计采用问卷调查3 767名居民, 寄生虫病防控知识知晓率为28.72% （1 082例）, 饭前洗手、 便后洗手、 生吃瓜果蔬菜洗净、 不喝生水等4种卫生行为形成率分别为60.66% （2 285例）、 50.17% （1 890例）、 48.71% （1 835例） 和87.07% （3 280 例）。 结论 结论 山东省平原地区农村居民蛔虫、 钩虫、 鞭虫和华支睾吸虫感染率较低, 但儿童蛲虫感染率相对较高; 居民寄生虫病预防知识知晓率较低, 卫生行为形成率亦较低, 应加强健康教育和健康促进工作。     

抗弓形虫感染ROP2核酸疫苗的研究

目的研究弓形虫核酸疫苗，以用于弓形虫病的防治。方法根据ROP2基因序列，设计合成能表达ROP2完整蛋白基因的扩增引物，扩增ROP2靶基因并克隆于PUCm—T载体，然后再亚克隆于真核表达载体pe—DNA3质粒中，制备弓形虫pe—DNA3—ROP2核酸疫苗；应用裸pc—DNA3—ROP2免疫小鼠，通过免疫学指标的检测，评价小鼠的免疫应答反应，最后应用弓形虫RH株攻击实验，评价出该疫苗的有效保护率、安全性和在人类及畜类的应用价值。结果以ROP2基因为模板，PCR扩增出1.7kb DNA条带，与预想结果一致；将扩增DNA回收并成功的克隆了ROP2（PUCm—T—ROP2），然后亚克隆并构建了pe—DNA—ROP2重组体，通过酶切、PCR扩增和基因测序证明亚克隆的重组子正确，ROP2扩增基因包含了ROP2蛋白基因读码框内的完整序列；在应用疫苗免疫接种小鼠结果显示。疫苗接种能使小鼠产生强烈的细胞、体液免疫反应；攻击实验结果显示，实验组小鼠的存活时间明显延长。并且开始死亡时间明显延迟（P〈0.001），实验组9只小鼠中有1只长期存活；在实验的整个过程中，没有发现小鼠对免疫接种的毒性和异常反应。结论该疫苗免疫原作用强，具有很好的开发应用价值，目前可在动物群体中试验应用。     

山东省人体寄生虫分布调查

根据卫生部下达全国人体寄生虫分布调查通知，以我国肠道寄生虫的种类、分布、危害程度及流行规律为调查目标，采取分层整群随机抽样方法开展调查。于１９８８年至１９９０年３年内，共调查１３个地（市）、３５个县（区）所辖１６１个调查点（村），计８５４１７人。共查见寄生虫感染者４８０８１例，其总感染率为６２．９％。查见线虫６种、吸虫２种、绦虫２种、原虫９种，共计１９种肠道寄生虫。其中，钩虫、蛔虫、鞭虫、蛲虫、猪带绦虫、华支睾吸虫、溶组织内阿米巴、贾第虫属于分布广泛、感染率高、危害较大的虫种。有关这些寄生虫病的流行现状和分布规律，为我省制定寄生虫病防治规划和措施，提供了可靠的依据。