两种DNA探针杂交检测结核分枝杆菌的研究

我们比较了结核分枝杆菌 (结核菌 )基因组ＤＮＡ及其聚合酶链反应 (ＰＣＲ)产物的灵敏度与特异性 ,并对结核病人痰标本进行了检测。一、材料和方法1 菌种来源 :2 4种分枝杆菌来自中国药品生物制品检定所 ,11种非分枝杆菌来自中国科学院微生物学研究所。2 标本收集 :90份痰标本来自本院结核科住院病人 ,经Ｘ线检查、临床表现确诊。 30份非结核病人痰标本来自本院呼吸科、肿瘤科及北京大学第三医院呼吸科住院病人。3 标本ＤＮＡ提取 :采用本室研制的标本前处理试剂盒。4 引物 :引物ａ :根据文献 [1]报道设计。扩增产物为35 0ｂｐ ,5′ ＧＡＡ…     

中国耐利福平结核分支杆菌rpoB基因突变特点

目的 为了阐明中国结核分支杆菌耐利福平析rpoB基因突变特点。方法 对242株结核分支杆菌临床分离包括rpoB基因核心区域81个碱基在内的588个碱基进行序列测定,其中耐利福平株193株,利福平敏感株46株,人工诱导的耐利福平株3株。结果 89．1％（172．193）的临床分离耐药株存在rpoB基因突变,而46株敏感株无突变。531位氨基酸突变率为46．1％;526位氨基酸突变率为17．1％;联合突变发生率为12．4％;还有4株细菌发生同义突变;未检测到发生缺失或插入突变的菌株。高耐药组（耐250μg/ml利福平）531位氨基酸的突变率显著高于低耐药组（耐50μg/ml利福平）,P＜0．05。结论 中国结核分支杆菌耐利福平株的rpoB基因突变的发生率约为90％,其中最常见的突变位点是531位丝氨酸和526位组氨酸,两者突变率之和约为63％;利福平高耐药组531位氨基酸发生突变的几率高于低耐药组;受度蓖株未发现搬运入或缺失突变;DNA序列分析对临床用药有指导意义。     

结核菌感染者微卡菌苗预防作用的研究

目的　观察、评价母牛分支杆菌菌苗(微卡苗)对结核菌感染健康人群PPD皮试强阳性者预防性治疗的效果。方法 对18～45岁PPD皮试强阳性健康人群分为微卡苗注射组、口服INH组和未处理对照组,观察对比治疗前、后的PPD皮试反应变化及发病情况。结果 治疗后较治疗前PPD反应:微卡苗组硬结平均直径显著减小(P<0.01),出现水泡、坏死者显著减少(P<0.01),INH预防组和未处理对照组二者变化较小(P>0.05)。观察1年微卡苗预防组无1人发病,INH预防组发病1例,未处理对照组发病4例。结论 微卡菌苗对结核菌感染者有较好的预防性治疗作用。     

应用PCR-RFLP分析结核分枝杆菌rpsL基因突变

目的 了解结核分枝杆菌链霉素(SM)耐药基因突变情况,建立快速检测耐药突变株的方法?方法 通过PCR-RFLP分析62株结核分枝杆菌临床分离株的rpsL基因突变的部位和性质?结果 以H37RV标准株为对照,13株敏感株的rpsL基因有MboⅡ酶切位点;37株耐SM分离株中,31株(838%)无MboⅡ酶切位点;12株耐其它抗结核药物株中,也有2株无MboⅡ酶切位点?结论 大多数结核分枝杆菌SM耐药分离株的核糖体S12蛋白编码基因(rpsL)第43位密码子有点突变?PCR-RFLP可能成为快速检测结核分枝杆菌耐药突变株的一种新方法?     

重组结核分枝杆菌PPE65蛋白的制备及其在肺结核诊断中的价值

目的 评价重组PPE65蛋白IgG抗体用于检测肺结核患者的价值.方法 将编码结核分枝杆菌PPE65蛋白的基因克隆到PET-28a载体,并在大肠埃希菌中表达,镍亲和层析和离子层析法纯化重组PPE65蛋白,透析复性和Lowry法测蛋白浓度.采用ELISA法检测144例肺结核患者、144名健康者、56例非结核肺部疾病患者血清中抗重组PPE65蛋白和重组PstS1蛋白的IgG抗体水平.用ELISA检测144例肺结核患者和97名PPD皮试阴性健康人血清IgG结果绘制ROC曲线确定临界值.分析评价重组PPE65蛋白及其与重组PstS1蛋白联合检测肺结核的敏感度、特异度、阳性预测值、阴性预测值、准确性.结果 结核分枝杆菌PPE65蛋白在大肠埃希菌中获得表达,层析纯化获得纯度为95%的重组PPE65蛋白,复性后蛋白浓度为0.5 mg/ml.重组PPE65蛋白IgG抗体的ELISA检测临界值为0.64.重组PPE65蛋白诊断肺结核的敏感度、特异度、阳性预测值、阴性预测值、准确性分别为34.7%(50/144)、93.5%(187/200)、79.4%(50/63)、66.5%(187/281)、68.9%(237/344);重组PPE65蛋白和重组PstS1蛋白联合诊断肺结核的敏感度、特异度、阳性预测值、阴性预测值、准确性分别为59.0%(85/144)、91.0%(182/200)、82.5%(85/103)、75.5%(182/241)、77.6%(267/344).结论 结核分枝杆菌PPE65蛋白可作为结核患者血清检测的蛋白抗原之一.PPE65蛋白和重组PstS1蛋白IgG抗体联合检测用于结核病诊断可提高敏感度.

Abstract：

Objective To evaluate the potential value of IgG antibodies against recombinant PPE65 protein (rPPE65) of Mycobacterium tuberculosis in serodiagnosis of tuberculosis.Methods The gene encoding PPE65 protein of M.tuberculosis was cloned into the PET-28a vector and then expressed in Escherichia coli.The rPPE65 was purified with Ni-NTA affinity and ion exchange chromatography.After dialysis renaturation, the concentration of rPPE65 was determined using Lowry assay.ELISA was used to detect the levels of specific IgG against rPPE65 and recombinant PstS1 protein (rPstS1) in sera from 144 patients with pulmonary tuberculosis (PTB patients), 144 health controls, and 56 patients with non-tuberculosis pulmonary diseases.ROC curves were used to determine cut-off values with the results of IgG antibodies against rPPE65 and rPstS1 for 144 PTB patients and 97 controls with negative PPD skin test.The sensitivity, specificity, positive predictive value (PPV), negative predictive value (NPV), and accuracy of rPPE65 and the combination of rPPE65 and rPstS1 were counted.Results The PPE65 protein of M.tuberculosis was successfully expressed in E.coli. The purity and concentration of rPPE65 were 95% and 0.5 mg/ml, respectively.ROC analysis showed that the cut-off of ELISA using rPPE65 was 0.64.The sensitivity, specificity, PPV, NPV, and accuracy of rPPE65 were 34.7%(50/144), 93.5%(187/200), 79.4%(50/63), 66.5%(187/287), and 68.9%(237/344), respectively.The sensitivity, specificity, PPV, NPV, and accuracy of the combination of rPPE65 and rPstS1 were 59.0%, 91.0%, 82.5%, 75.5%, 77.6%, respectively.Conclusions The rPPE65 of M.tuberculosis appears to be a candidate antigen for serodiagnosis of tuberculosis.Detection of IgG antibodies against the combination of rPPE65 and rPstS1 can increase the sensitivity of serological test for tuberculosis.     

重组结核分枝杆菌蛋白筛查结核分枝杆菌感染的试验研究

.0,均P>0.05).38000蛋白皮肤试验阳性反应直径多为5～9 mm,PPD试验阳性反应直径多为5～14 mill.结论 38000蛋白有望用于MTB感染的筛查.     

应用多重聚合酶链反应技术快速鉴定牛分支杆菌卡介苗株

目的 建立快速鉴定牛分支杆菌卡介苗(BCG)菌株的方法。方法 依据最近研究发现的牛分支杆菌BCG菌株不存在命名为缺失区1(deleted region 1，RD1)的基因区，而其他牛分支杆菌菌株和其他结核分支杆菌复合群(MTC)菌种(结核分支杆菌、非洲分支杆菌和田鼠分支杆菌)存在RD1基因区的遗传学信息，应用多重聚合酶链反应(PCR)检测RD1基因区存在与否，以鉴别BCG菌株与其他牛分支杆菌菌株及其他MTC菌种。结果 所试5株BCG疫苗生产用标准菌株和近期国内发生的1例小儿BCG接种后全身播散性感染致死病例的2株BCG分离菌株，均缺失RD1基因区；其他牛分支杆菌菌株，包括3株牛分支杆菌标准菌株、5株分别从结核病牛或鹿分离的牛分支杆菌菌株，1株从结核病患痰标本分离的牛分支杆菌菌株，以及其他MTC菌种，包括结核分支杆菌H37Rv和H37Ra标准菌株、48株从结核病患痰标本分离的结核分支杆菌菌株、3株非洲分支杆菌标准菌株，均存在RD1区。结论子多重PCR技术用于牛分支杆菌BCG菌株的鉴定简便、快速、特异，适于在临床实验室应用。     

分枝杆菌噬菌体应用研究展望

噬菌体是微生物学的一个重要分支 ,是一种专性感染并寄生于相应活的细菌体内的非细胞原生物 ,称为细菌病毒。噬菌体基本上包括裂解型和温和 (溶原 )型两类 ,与其他病毒有一些共同的生物学特性[1] :个体小 ,结构简单 ,有滤过性 ;没有独立的代谢酶系 ,只能在活的处于代谢状态的宿主菌体内繁殖 ;噬菌体感染细菌具有种属特异性 ,即一种噬菌体只能感染一个细菌种属 ,甚至于一个种属的几株细菌。噬菌体技术在各种细菌感染性疾病的诊断、治疗与预防方面已成功得到应用。从首次分离分枝杆菌噬菌体至今已有 5 0多年历史 ,从不同来源分离出噬菌体达 2 …     

母牛分支杆菌菌苗免疫治疗肺结核的临床观察

目的观察和评价通过母牛分支杆菌（Ｍ．ｖａｃｃａｅ）菌苗的免疫治疗缩短初治肺结核化疗疗程及对难治肺结核临床疗效的影响。方法初治肺结核１４２例及难治肺结核４６例，配对随机分为Ｍ．ｖａｃｃａｅ治疗组及单纯化疗对照组，观察加用免疫治疗后的疗效及其对免疫功能的调节作用。结果初治肺结核经免疫治疗后化疗疗程缩短至４个月近期疗效令人满意；难治肺结核痰菌阴转率明显高于对照组（Ｐ＜０．０５）；Ｍ．ｖａｃ－ｃａｅ可使ＣＤ４Ｔ及ＣＤ４／ＣＤ８升高。结论Ｍ．ｖａｃｃａｅ菌苗免疫治疗肺结核具有较大价值。