细胞周期素与膀胱癌关系的研究进展

细胞周期素是细胞周期调节的重要因子，和膀胱肿瘤的发生发展密切相关。细胞周期素的表达对判断肿瘤的生物学特征、预后有重要的意义，针对细胞周期素的特异抑制剂有望为膀胱癌的防治提供新的策略。     

肠出血性大肠埃希菌O157:H7Ⅱ型志贺毒素的纯化及功能鉴定

目的 亲和层析纯化肠出血性大肠埃希菌(EHEC)O157:H7Ⅱ型志贺毒素,并鉴定其生物学功能.方法 用抗-Ⅱ型志贺毒素分子A亚单位的抗体S1D8耦联至柱填料Sepharose 4B,制备亲和层析柱.纯化EHEC O157:H7菌体分泌的毒素分子,分别用聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDSPAGE)和Western印迹法鉴定毒素分子纯度和特异度,将纯化毒素倍比稀释,观察其对Vero细胞和小鼠的毒性作用,计算其对细胞半数致死量(CD50)和对小鼠的全数致死量(LD100);观察抗毒素血清对小鼠进行毒素攻击的保护作用.结果 通过亲和层析从EHEC O157:H7培养物中成功纯化Ⅱ型志贺毒素.SDS-PAGE显示,其A、B亚单位的相对分子质量分别为32 000和7 500,纯化的毒素分子可分别与Ⅱ型志贺毒素A、B亚单位特异性的单抗结合;对Vero细胞和小鼠均存在致死作用,其CD50和LD100分别为20 ng/L和5 ng,小鼠体内抗毒素血清对毒素可有效中和.结论 成功纯化Ⅱ型志贺毒素,并证实其在细胞和动物模型中的毒性作用.     

新型冠状病毒非结构蛋白1重要变异对其与病毒5’UTR结合能力的影响

目的探讨新型冠状病毒(2019 novel coronavirus, 2019-nCoV)非结构蛋白1(NSP1)重要变异对其与病毒5’UTR结合能力的影响, 为抗病毒药物和疫苗的研发提供线索。方法对2019-nCoV基因组数据库进行生物信息分析, 选取可能影响NSP1结构及与5’UTR的结合能力的氨基酸变异位点(T12A、R124L、N128I、K141A、GHVMV82-86DEL及KSF141-143DEL), PSIPRED在线工具分析变异体的二级结构, mCSM-NA预测其与RNA的结合能力, DynaMut webserver分析变异对蛋白稳定性的影响;构建变异体质粒, 转染HEK-293T细胞, 利用双荧光素酶报告基因实验和RNA结合蛋白免疫沉淀(RNA binding protein immunoprecipitation, RIP)实验检测NSP1变异体与病毒5’UTR的结合能力。结果生物信息分析预测除了R124L突变外, 其他5种变异体均可改变蛋白二级结构, T12A、R124L、N128I和K141A突变均可以降低与RNA的结合能力, 而T12A、R124L、N1...     

乙型肝炎表面抗原-破伤风类毒素结合疫苗的制备及免疫学特性

目的 制备乙型肝炎(乙肝)表面抗原(HBsAg)与破伤风类毒素(TT)结合疫苗,并研究其免疫学特性.方法 TT经溴化氢活化后与己二酰肼形成TT-酰肼基衍生物,在碳二亚胺作用下与HBsAg共价结合.将结合物、HBsAg及乙肝疫苗免疫小鼠,并设生理盐水对照组,分别于7、14、21、28 d取血,应用化学发光法检测小鼠血清抗-HBs,于第7、28天应用酶联免疫斑点法(ELISPOT)检测脾单个核细胞(mouomlclear cells,MNC)分泌HBsAg特异性IFN-γ和IL-2能力.结果 成功制备了HBsAg-TT结合物,该结合物诱导抗-HBs阳转率及抗体滴度均较单独免疫HBsAg及乙肝疫苗组高,主要以IgG2a抗体为主,且分泌IFN-γ和IL-2的淋巴细胞数也显著增加.结论 用该方法 制备的HBsAg-TY结合疫苗,不仅可诱导较强的体液免疫,还可诱导以TH1应答为主的细胞免疫.     

CRISPR - Cas13a结合重组酶介导的扩增快速检测副溶血性弧菌方法的建立

目的 将重组酶介导的扩增（RAA）技术与成簇的规律间隔短回文重复序列及其相关蛋白13a（CRISPR - Cas13a）检测系统相结合,建立一种快速、灵敏、特异的副溶血性弧菌检测方法（RAA - Cas13a）。方法 样本DNA经RAA扩增后,产物采用CRISPR - Cas13a检测系统进行检测,比较CRISPR - Cas13a与琼脂糖凝胶电泳对RAA产物的检测敏感性。对方法进行灵敏度与特异度测试,通过临床样本检测比较建立的方法与real - time PCR法的一致性。结果 CRISPR - Cas13a对RAA产物的检测敏感性高于琼脂糖凝胶电泳法;建立的RAA - Cas13a方法检测副溶血性弧菌的灵敏度为10拷贝DNA分子/反应,与其他病原体之间无交叉反应,与real - time PCR对临床样本的检测阳性率差异无统计学意义（P＞0.05）,二者的检测一致性较高（kappa = 0.934）。结论 建立的RAA - Cas13a方法具有快速简单、灵敏特异等优点,为副溶血性弧菌的快速检测提供了新的工具。     

Stxl-A亚单位的原核表达、复性及抗原性鉴定

目的 构建志贺毒素1-A亚单位(Stxl-A)原核表达质粒,使其在大肠埃希菌中表达,对表达的重组蛋白进行纯化,并探讨其抗原性及应用价值.方法 以大肠埃希菌0157 DNA为模板扩增Stxl-A基因,重组克隆入原核表达载体pET32a( ),转化大肠埃希菌B121(DE3),异丙基硫代-半乳糖苷(IPTG)诱导表达,包涵体经镍柱柱上复性和纯化,并对纯化产物进行Western印迹鉴定.结果 重组质粒经双酶协鉴定和测序分析后证实构建成功.重组蛋白经十二烷基磺酸钠一聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)显示,其表达量占细菌总蛋白量的15%左右,主要以包涵体形式存在,通过镍柱柱上复性获得纯化的可溶性Stxl-A蛋白,纯度达95%以上,Western印迹检测显示特异性条带.结论 成功构建了pET32a( )/Stxl-A重组质粒,并获得了具有抗原特异性的可溶性Stxl-A蛋白,为进一步制备抗Stxl-A抗体和研究其生物学功能奠定了基础.     

新型冠状病毒N亚基因组荧光定量PCR检测方法的建立及初步应用

目的建立一种快速检测新型冠状病毒N亚基因组(SgN)的方法, 探讨其在新型冠状病毒肺炎病例及环境样本中的应用价值。方法根据全球共享流感数据库(GISAID)公布的新型冠状病毒全基因组序列设计SgN特异性引物和探针, 优化退火温度、引物与探针浓度等反应条件, 建立新型冠状病毒SgN荧光定量PCR检测方法, 绘制标准曲线, 评价该方法的灵敏性、重复性和特异性。采用建立的病毒SgN荧光定量PCR检测方法检测21份环境和351份临床样本, 并选取25份SgN阳性样本进行病毒分离以评估该检测方法的应用效果。结果 SgN的引物和探针对新型冠状病毒具有良好特异性。初步建立的病毒SgN荧光定量PCR检测方法最低检测限为1.5×102copies/ml, 变异系数小于1%。372份样本的gRNA阳性率为97.04%(361/372), gRNA阳性样本中阳性环境样本和阳性临床样本的SgN阳性率分别为36.84%(7/19)和49.42%(169/342)。其中野生型毒株样本的SgN阳性率及拷贝数均比德尔塔(Delta)毒株低。在25份SgN阳性样本中, 采样时间在5 d内的12份样本均分离到病毒;13份...