实时荧光定量聚合酶链反应检测B7-H4基因表达的方法学构建

目的 建立实时荧光定量聚合酶链反应(PCR)检测协同刺激分子B7-H4基因表达的方法.方法 采用自行设计的检测协同刺激分子B7-H4及内参照基因GAPDH的引物及TaqMan探针,经优化反应体系及反应条件后,检测B7-H4及GAPDH的基因表达.将B7-H4和内参照基因GAPDH的PCR扩增产物经测序鉴定正确并纯化后分别与pMD19-T载体连接,克隆构建含B7-H4及GAPDH基因片段的重组质粒,作为实时荧光定量PCR检测B7-H4及GAPDH基因表达的标准品.将重组质粒标准品进行定量及梯度稀释,建立标准曲线.结果 PCR扩增产物分别经测序证实为B7-H4及GAPDH基因的特异性片段.该法检测B7-H4基因表达的灵敏度为527 copies/ml,线性范围为5.27×102～5.27×107 copies/ml,标准曲线方程为:Y=-3.1395X+41.805,直线回归相关系数r=0.995,批间变异系数范围为2.39%～3.59%,扩增效率108.2%.该法检测GAPDH基因表达的灵敏度为386 copies/ml,线性范围为3.86×102～3.86×107copies/ml,标准曲线方程为:Y=-3.2436X+41.083,直线回归相关系数r=0.999,批间变异系数范围为2.26%～3.86%,扩增效率103.4%.结论　成功构建实时荧光定量PCR检测协同刺激分子B7-H4基因表达的方法,该方法 特异性好、灵敏度高、重复性好.

Abstract：

Objective To establish a real-time polymerase chain reaction (PCR) method to detect costimulatory molecule B7-H4 gene expression. Methods The mRNA levels of costimulatory molecule B7-H4 and the reference gene GAPDH were detected by using real-time PCR using TaqMan technology. The primers and TaqMan probes of B7-H4 and GAPDH were designed. The B7-H4 and internal reference gene GAPDH fragments in pure form from classical PCR amplification were cloned into pMD19-T vector, and recombinant plasmids were used as the standard substances of B7-H4 and GAPDH quantitative detection.Standard curves were established using a serial dilution of quantified plasmids to measure B7-H4 and GAPDH. The reaction systems were optimized, and the sensitivity, specificity and reproducibility were evaluated. Results The amplification products were confirmed as the specific fragments of B7-H4 and GAPDH by DNA sequencing instrument. For B7-H4, the sensitivity was 527 copies/ml. The linear range was from 5.27 × 102 to 5.27 × 107 copies/ml, the standard curve equation was Y = - 3. 1395X +41. 805, the correlation coeffecient was 0. 995, the interassay coefficient of variations was 2. 39% -3.59%, and the amplification efficiency was 108.2%; For GAPDH, the sensitivity was 386 copies/ml. The linear range was from 3. 86 × 102 to 3.86 × 107 copies/ml, the standard curve equation was Y = - 3. 2436X +41. 083, the correlation coeffecient was 0. 999, the interassay coefficient of variations was 2. 26% -3. 86%, and the amplification efficiency was 103.4%. Conclusion The real-time PCR system for quantifying costimulatory molecule B7-H4 mRNA levels has been established successfully with high specificity, sensitivity and good repeatability.     

协同刺激分子B7-H4影响细胞因子诱导的杀伤细胞治疗胃癌预后的多因素COX模型分析

目的 探讨协同刺激分子B7-H4的表达与胃癌的关系,并分析B7-H4在胃癌组织中的不同表达水平对细胞因子诱导的杀伤细胞(CIK)治疗胃癌患者的复发和死亡的风险.方法 对156例胃癌病例(1998年1月1日至2009年12月31日),采用免疫组织化学染色及IHS评估法确定B7-H4的表达状态,使用回顾性队列研究方法调查每位病例的人口学、临床资料及复发时间和死亡时间.应用COX多因素模型分析B7-H4高表达影响胃癌复发和死亡的风险.结果 胃癌组织B7-H4高表达组与B7-H4低表达组比较,患者中位无瘤生存时间(月)及95%CI分别为16(11.9～20.1)和47(22.4～71.6),中位生存时间(月)及95%CI分别为25(19.0～31.1)和43(35.2～50.8).在化学治疗组中,B7-H4低表达患者的中位生存时间明显高于B7-H4高表达患者(36比16),差异有统计学意义(x2=14.14,P<0.01).在化疗联合CIK治疗组中,B7-H4低表达患者的中位生存时间有高于B7-H4高表达患者的趋势(55比34),但差异无统计学意义(x2=1.78,P>0.05).在化学治疗组中,B7-H4低表达患者中位无瘤生存时间高于B7-H4高表达(33比11),差异有统计学意义(x2=18.956,P<0.01).在化疗联合CIK细胞治疗组中,B7-H4低表达患者中位无瘤生存时间显著高于高表达组(90比18),差异有统计学意义(x2=3.842,P<0.05).在调整了性别、年龄等混杂因素后,与B7-H4低表达比较,B7-H4高表达组病例的复发和死亡风险明显增加(RR=2.30,95%CI=1.41～3.75;RR=1.90,95%CI=1.20～3.01).结论 B7-H4高表达可能是提高胃癌复发和死亡风险的独立危险因素.采用CIK细胞回输治疗可控制和干预B7-H4的表达并延长胃癌患者的中位生存时间,胃癌B7-H4低表达可作为CIK细胞治疗的纳入标准.     

肝癌患者血浆apoM水平与其他脂类的相关性研究

目的分析肝癌患者血浆中载脂蛋白M(apoM)的水平,阐明apoM与其他脂蛋白或载脂蛋白的关系。方法应用dot-blotting技术检测36例肝癌患者及64名健康人血浆中apoM的水平,酶法及比浊法检测肝癌患者血浆中TG、TC、apoAI、apoB、Lp(a)、HDL-C、LDL-C;比较原发性肝细胞癌患者和健康人血浆中apoM的水平,并对apoM与其他脂蛋白的关系进行相关性分析。结果血浆apoM水平肝癌组(712.87±345.98)INT/mm2明显高于健康人组(433.70±79.53)INT/mm2(t=3.399,P<0.05),差异具有统计学意义。肝癌患者血浆中的TG、HDL-C、apoAⅠ和Lp(a)水平明显低于健康人,而TC、apoB和LDL-C水平与健康人差异无统计学意义(P>0.05)。以Pearson相关分析法检测健康人组血浆apoM与Lp(a)呈正相关(r=0.6275,P=0.0005),与HDL-C呈负相关(r=-0.4587,P=0.0161),与其他血脂成分无明显的相关性。肝癌患者血浆apoM与血脂参数无相关性。结论肝癌患者血浆apoM水平明显高于健康人,apoM分析有可能作为判断肝癌受损程度的一种辅助指标。     

鱼藤素增加人胃癌细胞株SGC-7901对氟尿嘧啶的敏感性

目的 观察鱼藤素对胃癌细胞化疗敏感性的影响.方法 胃癌SGC-7901细胞以1 μmol/L鱼藤素处理24h后,噻唑蓝(MTT)比色法检测对其对氟尿嘧啶处理48 h的敏感性变化;经鱼藤素联合氟尿嘧啶(12.5 mg/L)处理后形态学观察进一步验证MTT结果;提取1μmol/L鱼藤素处理24 h后细胞总蛋白,Western blot法检测相关蛋白表达水平的变化.结果 鱼藤素预处理后可明显增强氟尿嘧啶对SGC-7901细胞的抑制作用,其IC50值降至7.86 mg/L(P＜0.05);增强氟尿嘧啶对SGC-7901细胞增殖抑制和凋亡诱导作用;鱼藤素可明显降低蛋白激酶B(Akt)的磷酸化水平.结论 鱼藤素可通过下调Akt的活性,增强SGC-7901细胞对氟尿嘧啶的敏感性,与化疗药物联用可能有助于提高抗肿瘤治疗效果.     

改良ARROW导管引流联合5-氟尿嘧啶、高聚生灌注治疗恶性腹腔积液

目的 探讨改良中心静脉导管置管引流系统（ARROW导管）引流联合5-氟尿嘧啶、高聚生灌注治疗恶性腹腔积液的疗效及安全性.方法 对26例恶性腹腔积液患者留置经过改良的ARROW导管,待积液放尽,在腹腔中灌注5-氟尿嘧啶及高聚生.结果 26例患者中CR 5例,PR 18例,SD 3例,有效率为88.5％.毒副反应患者能耐受...     

培美曲塞二钠联合卡铂治疗老年中晚期非小细胞肺癌的临床研究

目的观察培美曲塞二钠联合卡铂治疗老年中晚期非小细胞肺癌的临床疗效及不良反应。方法45例住院治疗的老年（65～80岁）中晚期非小细胞肺癌患者采用培美曲塞二钠（pemetrexed disodium,PEM）、卡铂（Carboplatin,CBP）方案联合化疗,PEM：500mg/m^2,静脉滴注,第1天;CBP：300mg/m^2,静脉滴注,第1天,21d为1周期。培美曲塞二钠24h前口服地塞米松4mg,2次／d,连服3d;培关曲塞二钠前1周口服叶酸400μg,1次／d,连服直到培美曲塞结束21d;培美曲塞二钠前1周予VitB12 1000μg肌注。按RECIST疗效及毒副反应评价标准评价,完成治疗2个周期以上的患者进行临床疗效及不良反应评估,计算疾病进展时间（TTP）和总生存期（OS）。结果有效率（RR）37．8％（17／45）,其中完全缓解（CR）0例,部分缓解（PR）17例,稳定（SD）22例,进展（PD）6例。中位随访8个月（2～20个月）,中位TTP 7个月（1．5,12．0个月）,中位OS 9个月（4～19个月）,1年生存率46．7％（21／45）。毒性反应主要为骨髓抑制、胃肠道反应．均未达到Ⅲ、Ⅳ度,均可耐受,经对症处理不影响化疗进行。结论培美曲塞二钠联合卡铂方案治疗老年中晚期非小细胞肺癌患者的疗效较好,不良反应较轻,患者的耐受性好。     

血清三种肿瘤标志物检测对胰腺癌诊断的意义

目的 建立一种检测血清恶性肿瘤相关物质(TSGF)、糖类抗原242(CA242)和糖类抗原19-9(CAl9-9)并用以诊断胰腺癌的方法。方法 用生化比色法与酶免法分别检测200名正常人、60例胰腺炎患者、4l例恶性淋巴瘤患者及85例胰腺癌患者的TSGF、CA242和CAl9-9含量。结果 TSGF、CA242和CAl9-9的真阳性百分率与假阳性百分率之比，即似然比(LR)。其中阳性似然比依次为5．4、12．7和6．6，阴性似然比依次为0．10、0．19和0．15。敏感性最高TSGF(91．8％)，特异性最高CA242(93．5％)，TSGF与CAl9-9有效性相近。以3项均为阳性诊断胰腺癌：其敏感性为77．6％，而特异性和阳性预测值皆为100％。结论 用TSGF、CA242和CAl9-9联合诊断胰腺癌可提高特异性和有效性。3项指标联合检测对胰腺癌的诊断有十分重要的意义。     

CT引导125I粒子植入术治疗胃癌术后区域淋巴结转移

目的 评价CT引导125I粒子植入术治疗胃癌术后区域淋巴结转移的安全性与近期疗效.方法 对23例胃癌术后局限性区域淋巴结转移并接受CT引导125I粒子植入治疗患者的临床病理特征与生存资料进行回顾性分析.所有患者术前经放射性粒子植入计划系统模拟布源,计算放射性粒子总活度与粒子数量.CT引导下经皮穿刺植入125I粒子.术后2个月参照实体瘤疗效评价标准(RECIST)评价近期疗效,采用寿命表法计算植入术后患者1、2和3年生存率;以单变量Cox模型检验相关因素对生存的影响;采用log-rank法比较组间(肿瘤最大径＞3 cm组和＜3 cm组)生存差异并绘制生存曲线.20例患者粒子植入术后接受了以氟尿嘧啶类药物为基础的全身化疗.结果 23例患者均未出现严重并发症.CR 14例(60.9％,14/23),PR 5例(21.7％,5/23),PD 4例(17.4％,4/23).患者粒子植入术后1、2和3年生存率分别为(87±7)％、(47±11)％与(13±9)％,中位生存时间为(22.1±5.1)个月.单变量Cox分析,肿瘤最大径是影响生存时间的因素(x2=9.752,P=0.002),＞3 cm组和＜3 cm组的中位生存时间分别为(17.0±5.0)和(30.0±5.1)个月,2组总生存时间差异具有统计学意义(x2=5.828,P=0.016).结论 CT引导1251粒子植入术治疗胃癌术后局限性区域淋巴结转移创伤小且并发症少,并能取得较高的局部控制率.     

谷胱甘肽-S-转移酶P1基因多态性与晚期胃癌患者对顺铂化疗疗效的相关性研究

目的 基因多态性通过影响药物的代谢、转运和作用靶点从而导致药物疗效和毒性的个体差异,寻找明确的生物学标记来识别获益人群已成为最大的挑战.本研究旨在观察谷胱甘肽-S-转移酶P1(GSTP1)基因多态性与以顺铂(DDP)为基础的化疗方案治疗晚期胃癌疗效间的关系.方法 收集经病理学确诊的晚期胃癌患者59 例.所有病例化疗前抽取外周静脉血,提取脱氧核糖核酸(DNA),用连接酶检测反应技术(PCR-LDR)检测研究对象的GSTP1 基因型.所有患者经多西他赛(DOCETAXEL)/DDP/5-氟尿嘧啶(5-FU) 联合方案化疗,化疗结束后观察疗效及其与GSTP1 基因多态性的关系.结果 59 例晚期胃癌患者中,15 例(25.4%)为GSTP1 G/G 基因型,21 例(35.6%)为GSTP1 G/A 基因型,23 例(39.0%)为GSTP1 A/A 基因型.其中4 例完全缓解,14 例部分缓解,19 例稳定,22 例进展,总有效率为30.5%(18/59).GSTP1 G/G 基因型患者的化疗有效率(73.3%)明显高于G/A 基因型患者(19.0%)(χ2 ＝10.616,P ＝0.005),同样明显高于A/A 基因型患者(13.0%)(χ2 ＝14.202,P ＝0.001).G/A 基因型患者的化疗有效率与A/A 基因型患者之间差异无统计学意义(χ2 ＝0.31,P＝0.856).突变基因型(G/G +G/A)对化疗较敏感,其化疗有效率是野生基因型(A/A)的3.2 倍(95% CI 1.442 ～7.302,P ＝0.004).结论 GSTP1 基因型对预测以DDP 为基础化疗方案治疗晚期胃癌的疗效具有较好的临床意义.     

肝癌患者血浆载脂蛋白M水平的检测

原发性肝细胞癌是我国常见的恶性肿瘤之一，在肝癌肝细胞损伤的情况下，可导致血浆脂质和脂蛋白结构的改变。载脂蛋白M（ApoM）是由Xu于近年发现并从乳糜微粒中分离及克隆的一种高密度载脂蛋白。本研究旨在检测肝癌患者血浆中ApoM的水平，并对ApoM和其他脂质成分进行相关性分析。[第一段]