CDG-3荧光探针检测结核分枝杆菌的初步研究

目的 探讨CDG-3荧光探针[β-内酰胺酶(BlaC)特异性绿色荧光探针]用于结核病诊断的潜在可能性。方法 为明确CDG-3荧光探针的特异性,选取结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,MTB)标准株H37Rv,牛和非洲分枝杆菌标准株,35种临床相对常见的不同非结核分枝杆菌(nontuberculous mycobacteria,NTM)标准株和6种呼吸道感染病原菌标准株,与CDG-3荧光探针反应后进行检测;为初步了解CDG-3荧光探针临床应用效果,收集2016年1月至9月于北京胸科医院门诊就诊的200例疑似肺结核患者的痰标本分别进行金胺O荧光染色法、培养法(罗氏固体培养联合MGIT960液体培养,二者只要有一种结果为阳性即认为培养阳性)和CDG-3荧光探针检测,并对检测结果进行分析。结果 以H37Rv为标准,CDG-3荧光探针检测牛和非洲分枝杆菌标准株结果均为阳性。试验的35种NTM标准株中,CDG-3荧光探针检测结果阳性的菌株仅有3株,分别是堪萨斯分枝杆菌、玛尔摩分枝杆菌和草分枝杆菌;其余32株的检测结果为阴性。6种呼吸道感染病原菌中,5种检测结果为阴性,1种(诺卡菌)为阳性。在临床痰标本实验中,CDG-3荧光探针对痰MTB的阳性检出率为53.0%(106/200),高于金胺O荧光染色法(29.5%,59/200)与培养法(35.0%,70/200)的阳性率,差异有统计学意义(χ ²值分别为33.587、21.121,P值均为0.000)。以培养法结果为标准,CDG-3荧光探针检测的敏感度为84.3%(59/70),高于金胺O荧光染色法(70.0%,49/70);特异度为63.8%(83/130),低于金胺O荧光染色法(92.3%,120/130);以临床诊断为标准,CDG-3荧光探针检测的敏感度为64.4%(96/149),高于金胺O荧光染色法(39.6%,59/149)和培养法(44.3%,66/149);特异度为95%(19/20),低于金胺O荧光染色法(100%,20/20),高于培养法(90%,18/20)。 结论 CDG-3荧光探针对MTB的选择性较好,受NTM干扰较小,与呼吸道感染病原菌的反应还需进一步研究;CDG-3荧光探针技术具有快速、简便、检出效率高等优势,但特异度有待进一步提高。     

结核分枝杆菌肝素结合血凝素在肺结核及肺外结核中的免疫作用研究

目的探讨结核分枝杆菌肝素结合血凝黏附素（heparin-binding hemagglutinin adhesin, HBHA）在不同结核感染状态人群中免疫反应及可能的诊断价值。 方法用天然的HBHA刺激选取阴性对照、潜伏感染者、肺结核和肺外结核患者,分离外周血单个核细胞,加入共培养,收集细胞培养上清,ELISA方法检测上清中IFN-γ的浓度,运用非参数检验的方法统计分析。结果4组HBHA特异的IFN-γ分泌水平分别为49.5、781.9、341.8、214.4pg/ml,潜伏感染者组远高于其他各组,HBHA 刺激后肺结核和肺外结核之间的IFN-γ分泌水平无统计学差异（U＝1901.5,P＝0.448）。结论HBHA特异的IFN-γ分泌水平,有利于鉴别健康人群中的潜伏感染者,HBHA可能具有一定的免疫保护作用,尽管HBHA与肺外结核发病相关,其特异的细胞免疫在肺结核和肺外结核间无统计学差异。     

牛分枝杆菌感染巨噬细胞（THP-1）全基因表达谱变化的研究

目的分析可用于牛结核病免疫学诊断的候选靶标,同时初步探讨由牛分枝杆菌（Mycobacterium bovis）引起人结核病的免疫学发病机制。方法牛分枝杆菌 (AF 2212/97)和结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis(H₃₇Rv)）感染人的模式巨噬细胞（THP-1）,采用含有22000个基因全长的基因芯片分析感染72h后的THP-1细胞全基因组的在转录水平的表达谱变化。在确定所分析的芯片的特异性和稳定性均达到要求的基础上,通过GO显著性统计分析,研究表达变化的基因所对应蛋白的分子功能,生物过程以及细胞组分;进一步采用Pathway显著性统计分析,研究表达差异蛋白之间的相互作用。结果感染H₃₇Rv后的THP-1细胞,存在290个差异基因表达,其中170个上调表达,120个下调表达,与以往的结果类似。牛分枝杆菌感染的THP-1细胞中有1899(8.6%)个基因差异表达,其中1075个基因被上调表达(56.6%),其他43.4%被下调。1899个基因中1674个在GenBank有记录,263个是新基因,,基质金属蛋白酶12(H200000442)被上调达60.4921倍;下调幅度最大的蛋白丝氨酸/半胱氨酸抑制酶(H200006177)被下调6.29倍。采用GO分析发现,这些基因对应的多为炎症因子蛋白、凋亡蛋白、细胞外基质蛋白、T细胞受体信号通路相关蛋白等。其中与炎症相关的的蛋白有47个,如TNF、IL8、CXCL3、CCL8、CCL7、IFNK、IL-26、CCL28等。随后的Pathway分析差异表达基因对应的2014个蛋白,展示了一系列的引起结核病发病的重要信号传导通路。结论基因表达谱研究可为牛结核病发病机制及其诊断研究提供大量有益的生物学信息。     

肺结核患者外周血单核细胞中差异表达miRNA的筛选

目的 研究肺结核患者外周血单个核细胞中miRNA的差异表达。 方法 选择10例肺结核患者和10例健康人。每人抽取5 ml静脉血,提取外周血单个核细胞（PBMC）,分别将肺结核患者组和健康对照组的PBMC混合,提取总RNA和miRNA,进行miRNA荧光标记和纯化,用芯片筛选差异表达的miRNA,以校正后的两个样本间杂交信号强度的比值,来判断芯片的结果。以实时定量PCR验证。 结果 筛选出26个差异表达的miRNA,其中13个上调的miRNA和13个下调的miRNA。通过比较肺结核患者与健康对照者实时定量PCR结果证实,hsa-miR-1（分别为1.085±0.005,1.018±0.011）表达上调（t=4.334, P<0.01）,hsa-miR-146a(分别为0.948±0.008,1.036±0.005)（t=4.460, P<0.01）与hsa-let-7e(分别为1.020±0.007,1.091±0.004)（t=4.149, P<0.01）表达下调。 结论 多种miRNA在肺结核患者外周血单个核细胞中有异常表达。     

做好终止结核病的全面准备——新年新起点

正结核病是伴随人类历史最长,造成人类死亡人数最多的一类传染病[1]。2015年是全球结核病防治事业的转折点,是全球"千年发展目标(MDGs)"最后一年,预示着全球由"千年发展目标"转向"可持续发展目标(SDGs)",也是结核病防治由"遏制结核病策略"[2]转向"终止结核病策略"[3]的新开端。终止结核病的标准是要在2035年时使结核病死亡率降低95%,发病率降低90%。基于全球结核     

三种外排泵抑制剂对氧氟沙星药物抗结核分枝杆菌最低抑菌浓度的影响

目的研究三种外排泵抑制剂对氧氟沙星(OFLX)抗结核分枝杆菌最低抑菌浓度(MIC)的影响。方法在96孔板上应用加入变色剂的7H9培养基进行实验。OFLX经倍比稀释后一系列药物浓度对12株结核分枝杆菌临床分离株的抑菌作用作为对照。经过实验确定羰基氰氯苯腙、维拉帕米和利血平三种常用外排泵抑制剂对OFLX抗结核分枝杆菌MIC的影响。结果三种泵抑制剂对OFLX抗8株OFLX耐药菌MIC呈现了不同程度的影响。在8株耐药菌中利血平对OFLX的MIC值降低了32～64倍,影响均非常明显。8株耐药菌中的6株菌维拉帕米与羰基氰氯苯腙两种泵抑制剂对OFLX的MIC影响程度相同,其中4株菌的MIC值几乎不影响,另外2株菌的MIC值降低了32倍。8株耐药菌中的另2株菌维拉帕米与羰基氰氯苯腙对OFLX的MIC值影响的差异却高达32倍。三种泵抑制剂对4株敏感菌OFLX的MIC影响相对一致,影响总体表现较小。结论三种抑制剂因其机制不同导致其对OFLX抗结核分枝杆菌的影响存在差异。对敏感菌影响相对一致,对耐药菌呈现不同的影响程度。     

临床标本中结核分枝杆菌抗原蛋白鉴定的研究进展

结核病是由结核分枝杆菌感染导致的严重的呼吸系统传染病,其传播隐匿,防控难度大。目前的结核病快速发现技术存在一定缺陷,亟需新的诊断技术。抗原检测技术具有适用广泛、操作简便、快速精确的优点,但尚未发现具有良好的稳定检测效果的靶标。另外,即使是针对同一抗原靶标,不同研究的检测效能差异也较大。因此,笔者对不同鉴定方法和实验研究证实的各种临床标本中存在的抗原蛋白的检测状况进行综述,以重新思考结核分枝杆菌抗原在临床标本中实际存在的状态和含量,以及改进抗原发现和鉴定的方法,为结核病抗原诊断技术的发展提供理论参考。     

爱因斯坦医学院生物医学博士研究生培养特点与启示

美国爱因斯坦医学院博士研究生培养模式相对比较完善。该校博士研究生培养模式的优点主要体现在以下三个方面：①精细而又全面的科研能力培养训练;②过程控制的高度重视;③宽进严出的质量保证体系。在这种培养模式下逐步形成了包容、竞争、灵活、自由的医学博士培养特点。借鉴国外的先进医学博士培养经验,我国的医学博士研究生的培养应当在加强导师指导小组作用、切实保障学生利益、深化学术交流以及满足社会多方面需求方面做出进一步努力。     

结核分枝杆菌黏附素HBHA的克隆表达及其免疫原性研究

目的应用克隆表达技术从大肠杆菌中获得重组的结核分枝杆菌黏附素HBHA蛋白,并以HBHA免疫小鼠观察抗HBHA抗体的产生并探讨其免疫原性。方法1)应用PCR技术扩增结核分枝杆菌hbhA编码基因的特异片段。2)结核分枝杆菌hbhA编码基因的克隆及在大肠杆菌中的表达。3)应用克隆表达的HBHA蛋白免疫小鼠,并用ELISA法测定小鼠血清抗HBHA抗体水平。结果1)结核分枝杆菌hbhA基因成功地克隆到PET-32 a(+)表达载体中,并在大肠杆菌中获得了高效表达。重组HBHA主要存在于包涵体中,纯化包涵体并获得了大量的重组HBHA。2)重组HBHA免疫小鼠可产生较高水平的抗HBHA抗体(>1∶102 400),表明重组HBHA在纯化过程中仍保留较强的免疫原性。结论结核分枝杆菌黏附素HBHA具有较好的免疫原性。