适用于结核分枝杆菌微测序耐药基因芯片的多重PCR体系的优化与评价

目的优化结核分枝杆菌耐药相关基因多重PCR反应体系并评估其优缺点。方法利用改进的方法提取结核分枝杆菌基因组DNA,优化适合扩增rpoB,katG,mabA/inhA,pncA,embB,gyrA,rpsL,rrs和eis耐药基因片段的多重PCR体系,经测序确定所扩增出的基因片段,计算PCR操作过程所用的时间和材料成本等,分析多重PCR反应体系存在的优缺点。结果经过优化煺火温度、引物浓度以及添加NH 4^+和二甲基亚砜可以较好的扩增出5重和4重PCR产物,达到两管同时扩增9个结核分枝杆菌耐药相关基因的目的。利用该条件可以扩增出全部培养出的135株菌株DNA样本和80.56%的痰菌DNA样本,并且可以缩短PCR操作时间、降低试剂耗材成本,减少操作失误。结论优化的两管多重PCR法在同时扩增9个结核分枝杆菌耐药相关基因,具有明显的优势,具有良好的实用价值。     

whi基因及其在分枝杆菌中特点和功能

链霉菌的孢子一般为灰色的，通常将形成白色孢子的相关突变基因命名为whi基因。Hopwood等人是较早研究whi基因的。通过对50种链霉菌白色孢子突变体进行相应的序列及图谱结果分析．研究者通常将这些显白色孢子的基因突变分为八类：分别为whiA、whiB、whiD、whiE、whiG、whiH、whiI和whiJ。最近又通过亚硝基胍（NTG）诱导产生的whi突变子中发现了五个新基因：whiK、whiL、whiM、whiN、whiO。     

畜禽结核病及其危害

结核病是由分枝杆菌引起的人、畜共患的一种慢性传染病。其特征是病畜逐渐消瘦，在各种器官形成无血管的干酪样变性的结节，称为结核。分枝杆菌除感染人类外，尚能引起50多种哺乳动物和25种禽类发病。其中对畜禽感染力较强的是结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis）、牛分枝杆菌（Mycobacterium bovis）和禽分枝杆菌（Mycobacterium avium）。所有家畜均能感染，牛最容易发生，羊、猪和禽类较少。上休3娄分枝杆菌同样帆黩染人．     

结核分枝杆菌thyA基因突变与对氨基水杨酸钠耐药关系的研究

目的 了解Mtb临床分离菌株中对于对氨基水杨酸钠（PAS）的耐药率及PAS耐药性与thyA基因突变的关系。 方法 从肺结核患者的痰标本中分离并鉴定Mtb 96株,采用比例法、全基因测序的方法检测上述Mtb临床菌株对PAS的耐药性情况及其thyA基因突变情况。结果 96株Mtb中,65株为PAS敏感菌株和31株为PAS耐药菌株。以Mtb标准菌株H37Rv为对照,筛选敏感和耐药菌株中的thyA基因突变率分别是46.15%（30/65）、70.97%（22/31）,突变多为单个碱基的缺失和插入突变,其中又以第19位密码子缺失C、第168位密码子缺失C为主,在耐药中所占比率分别是54.84%（17/31）、25.81%（8/31）,其在敏感菌株中的比率也分别是35.38%（23/65）、12.31%（8/65）。结论 耐药菌株中thyA基因的突变频率明显高于敏感菌株,thyA基因可能是PAS耐药潜在靶点,但未发现其特异性突变位点。     

结核分枝杆菌肝素结合血凝素与纯蛋白衍化物的细胞免疫作用比较

目的 通过结核分枝杆菌肝素结合血凝素(HBHA)与纯蛋白衍化物(PPD)的免疫作用比较,探讨HBHA的免疫保护作用及诊断应用价值.方法 选取阴性对照者、潜伏感染者、肺结核患者,分离入选者的外周血单个核细胞,分为无刺激、HBHA、PPD刺激组,培养4 d后收集细胞培养上清,ELISA方法检测上清中的γ-干扰素(IFN-γ)和白介素4.结果 HBHA刺激后3组产生的IFN-γ中位数分别为49.5 ng/L、781.9 ng/L、341.8 ng/L,潜伏感染者产生的IFN-γ水平远高于阴性对照者,略高于肺结核患者.HBHA特异的IFN-γ在不同治疗时间肺结核之间有显著差异.结论 HBHA有较好的免疫原性,可以刺激潜伏感染者产生高水平的IFN-γ,潜伏感染者未发展为活动性结核病可能与HBHA的免疫保护作用有关.HBHA特异的IFN-γ释放反应有利于鉴别潜伏感染者.     

牛分枝杆菌感染巨噬细胞（THP-1）全基因表达谱变化的研究

目的分析可用于牛结核病免疫学诊断的后选靶标,同时初步探讨由牛分枝杆菌（Mycobacterium bovis）引起人结核病的免疫学发病机制。方法牛分枝杆菌（AF2212／97）和结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis（H37Rv））感染人的模式巨噬细胞（THP-1）,采用含有22000个基因全长的基因芯片分析感染72个小时后的THP-1细胞全基因组在转录水平的表达谱变化。在确定所分析的芯片的特异性和稳定性均达到要求的基础上,通过GO显著性统计分析,研究表达变化的基因所对应蛋白的分子功能、生物过程以及细胞组分;进一步采用Pathway显著性统计分析,研究表达差异蛋白之间的相互作用。结果感染H37Rv后的THP-1细胞,存在290个差异基因表达,其中170个上调表达,120个下调表达,与以往的结果类似。牛分枝杆菌感染的THP-1细胞中有1899（8．6％）个基因差异表达,其中1075个基因被上调表达（56．6％）,其它43．4％被下调。1899个基因中1674个在GenBank有记录,263个是新基因,基质金属蛋白酶12（H200000442）被上调达60．4921倍;下调幅度最大的蛋白丝氨酸／半胱氨酸抑制酶（H200006177）被下调6．29倍。采用GO分析发现,这些基因对应的多为炎症因子蛋白、凋亡蛋白、细胞外基质蛋白、T细胞受体信号通路相关蛋白等。其中与炎症相关的的蛋白有47个,如TNF、IL8、CXCL3、CCL8、CCL7、IFNK、IL-26、CCL28等。随后的Pathway分析差异表达基因对应的2014个蛋白,展示了一系列引起结核病发病的重要信号传导通路。结论基因表达谱研究可为牛结核病发病机制及其诊断研究提供大量有益的生物学信息。     

细菌中非编码小RNA的研究进展

非编码小RNA（small non—coding RNA,sRNA）,sRNA广泛存在于从细菌到高等哺乳动物的各种生物体中,长度大约在50～250bp范围内。sRNA虽然不合有任何的开放阅读框（ORF）,但是在调节基因表达方面却发挥了重要作用。2002年12月20日,Science杂志将“Small RNA＆RNAi”评为2002年度的最耀眼的明星^[1]!同时,Nature杂志亦将Small RNA评为年度重大科技成就之一^[2]。sRNA研究的突破性进展,是生物医学领域近20年来,可与人类基因组计划相提并论的最重大成果之一。     

结核分枝杆菌对人急性白血病单核细胞株THP-1凋亡和死亡水平的影响

目的 通过对不同毒力的结核分枝杆菌感染细胞后的细胞凋亡和死亡程度的检测,以期发现结核分枝杆菌和细胞相互作用的新的方向和观点,以及对结核病免疫学发病机制的新认识.方法 选用不同毒力的结核分枝杆菌H37Ra、H37Rv及北京基因型敏感菌株(BJTB)分别感染人的巨噬细胞THP-1细胞株,模拟细胞体外感染的过程.以流式细胞仪检测细胞凋亡水平,免疫荧光检测细胞的凋亡蛋白的分布,末端脱氧核糖核酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记染色检测细胞晚期凋亡的变化,台盼兰染色检测细胞死亡水平的变化.结果 H37Ra引起THP-1细胞的凋亡水平最高,H37Rv次之,BJTB引起的凋亡水平最低.BJTB引起的死亡水平最高,H37Rv次之,H37Ra最低.结论 毒力不同的结核分枝杆菌刺激细胞后和细胞的相互作用不同,毒力越高引起的凋亡水平越低,毒力越低引起的凋亡水平越高;对死亡水平的影响是毒力越高的结核分枝杆菌引起的死亡水平越高,毒力越低引起的死亡水平越低.     

观察改良的药物敏感性检测法对检出耐药结核分枝杆菌的影响

目的利用经改良的最低抑菌浓度法（IMIC）检测结核分枝杆菌临床分离株对异烟肼、利福平、乙胺丁醇、链霉素和氧氟沙星的药物敏感性,观察其对耐药结核分枝杆菌检出的影响。方法利用改良的最低抑菌浓度法检测135株临床分离株对INH、RFP、EMB、SM及OFLX的敏感性。结果在相同的药物浓度中,与接种1×10^5/ml菌量的试验管相比135株接种1×10^7/ml活菌数的试管中有68.89%的结果与之相同,有31.1%的结果与之不相同。判断结果由阴性转阳性的标本共有20株,（其中耐RFP的1株、耐INH的3株、耐OFLX的3株、耐EMB的5株以及耐SM的8株）约占135株受试菌株总数的14.8%。结论利用改良的最低抑菌浓度法可发现潜在的耐药结核病患者,提高耐药菌的检出率。     

天津地区临床分离结核分枝杆菌分型的初步研究

目的探讨天津地区结核分枝杆菌临床分离株分子流行病学特征。方法连续收集天津市海河医院2005年8月16日11月25日就诊患者痰培养阳性的结核分枝杆菌100株，采用间隔区寡核苷酸分型（spoligotyping）和多位点可变串联重复序列（VNTR）两种方法进行基因分型，并运用软件对二者的结果进行分析。依据北京分化支的定义，运用多重和实时定量PCR方法将其区分为W菌／典型北京家族菌株和非典型北京菌株，Χ^2检验分析两种亚群与患者年龄和耐药性之间的联系。结果排除污染菌株，共对96株结核分枝杆菌临床分离株进行两种方法的基因分型，spoligotyping结果91．7％为北京基因型（含3株类北京基因型）结核分枝杆菌（88／96）。VNTR分型可将北京基因型分为60种基因型。在北京分化支结核分枝杆菌中，W菌／典型北京家族菌株占93．2％（82／88）。两种北京分化支亚群与患者年龄及耐药性之间差异无统计学意义（P〉0．05）。结论天津地区结核病患者临床分离的结核分枝杆菌中，北京基因型呈现较为明显的优势。VNTR的分辨率明显高于spoligotyping。北京分化支的两种亚群在天津地区临床结核病患者中均有流行，但以W菌／典型北京家族菌株为主。