肾移植受者巨细胞病毒隐性感染的筛查方法及应用

目的探讨肾移植受者巨细胞病毒(cytomegalovirus,CMV)隐性感染的筛查方法,为临床早期发现CMV活动性感染提供诊断依据。方法收集笔者医院2009年10～12月期间门诊随访233例肾移植受者外周静脉血标本450份,分别采用实时荧光定量PCR(Real-time PCR)、巢式PCR(nPCR)以及酶联免疫吸附(ELISA)法对标本进行检测,同时采用ELISA法检测他克莫司(Tac)浓度。结果 233例肾移植受者CMV-IgG均为阳性,CMV-IgM则均为阴性;Real-time PCR技术检测CMV-DNA阳性85例(36.48%),以低拷贝数为主。nPCR技术检测CMV-DNA阳性10例(4.29%),两种技术检测总阳性率存在显著性差异(P<0.05);随着Tac药物浓度升高,CMV-DNA阳性率呈增高趋势,药物高浓度组CMV-DNA阳性率高于低浓度组(P<0.05)。结论 Real-time PCR是筛查肾移植受者CMV隐性感染较为理想的方法,尤其在受者药物浓度偏高时更具有临床应用价值。     

口干、多饮、多尿3年余, 骨痛3个月

正病例摘要患者男,60岁,因"口干、多饮、多尿3年余,骨痛3个月"于2014年1月22日入住北京协和医院。现病史患者于2010年7月起无明显诱因出现口干、多饮、多尿,每20分钟需饮水1次,每次约200 ml,喜冷饮,伴尿量增多(每日6 L),夜尿5~6次/d。于当地医院查尿比重1.005~1.008,血钠149.5 mmol/L,余大致正常;行禁水-加压试验后诊为"中枢性尿崩     

硫酸钙／骨基质明胶在修复兔尺骨骨缺损中的实验研究

目的探讨硫酸钙／骨基质明胶可降解复合人工材料用于兔尺骨骨缺损的修复效果。方法选取已建立尺骨缺损模型家兔30只,采用随机数字表法将其分为3组,即空白对照组、单纯硫酸钙组及硫酸钙／骨基质明胶组,比较3组家兔术后12周骨痂形成率、骨性修复率及双轨征出现率、骨缺损修复X线片评分、尺骨扭转强度等。结果硫酸钙／骨基质明胶组骨痂形成率为93．33％、骨性修复率为86．67％、双轨征出现率为93．33％、骨缺损修复x线片评分（11．85±2．14）分、尺桡骨扭转强度（0．87±0．13）N×M,5项均明显高于单纯硫酸钙组和空白对照组,差异有统计学意义（P〈0．05）。结论硫酸钙／骨基质明胶可降解复合人工材料,用于兔尺骨骨缺损修复效果显著,可有效促进骨痂形成及骨结构修复。     

改良通用茎环引物筛查和定量检测微小RNA方法的建立

目的 建立可同时筛选和定量检测成熟型miR的荧光定量PCR方法.方法 改良通用茎环引物,在其茎环尾端引入8个随机碱基片段,用于成熟型miR逆转录,以建立SYBR Green PCR筛选和定量检测miR的方法(简称“改良通用茎环引物miR法”).同时,采用10倍梯度稀释的miR-155标准品cDNA(1～109拷贝/μl)评价其灵敏度;采用熔解曲线评价其检测miR-155的特异性;通过对2×105、2×106、2×107拷贝/μl的miR-155标准品cDNA分别进行批内20次重复实验,以其循环阈值(Ct)的变异系数(CV)评价其精密度;并与传统茎环法进行比较,计算实验所用时间和引物成本.然后,采用改良通用茎环引物miR法对植物血凝素(PHA)刺激培养0、16、24、48、72 h的人外周血T淋巴细胞内miR进行筛选(87个靶miR,经PubMed检索可能与免疫功能相关),并用以进行miR定量检测分析.结果 建立的改良通用茎环引物法的最低检测限为103拷贝/μl的miR-155 cDNA标准品;熔解曲线于80℃呈单峰,证实为针对miR-155的特异性扩增;其批内重复实验的精密度为CV＜2.5％.优化后的通用引物方法与传统方法相比较,节约引物约75％(1 917 bp比7 851 bp),节省逆转录时间约120min(85 min比205 min).用改良通用茎环引物法筛选T淋巴细胞中87个miR,85个miR在PHA刺激前、后的Ct无变化,而miR-150和miR-155表达量在T淋巴细胞激活前后分别发生超过10倍下降(72 h)和8倍的升高(48 h),且差异有统计学意义(Z=-2.023,P=0.043;Z=-2.032,P=0.042).结论 建立的改良通用茎环引物miR法具有快速、重复性好、灵敏、节约引物用量和实验时间的优点,可用于T淋巴细胞的miR筛查和定量检测.     

BMP-2和VEGF在大鼠骨缺损修复过程中的表达和意义

目的探讨二型骨形态发生蛋白(BMP-2)和血管内皮生长因子(VEGF)蛋白在大鼠股骨缺损修复过程中的表达和意义。方法 SD大鼠左侧股骨制备1个5 mm缺损,在手术后1周、2周、4周、8周后对大鼠进行X线照射,然后处死所有动物,收获新生骨组织和缺损两端的组织,做苏木素-伊红(HE)染色以及BMP-2和VEGF的免疫组织化学染色。结果 X线检测和HE染色均表明8周时骨缺损在对照组没有愈合,存在骨不连现象;BMP-2和VEGF在手术后第4周时表达达到高峰,并且在骨缺损断端和周围区域表达较缺损中心多。结论持续添加外源性BMP-2和VEGF因子有助于骨缺损的修复,有重要的临床意义。     

低强度脉冲超声经整合素-FAK-p38 MAPK通路对膝关节脂肪垫共培养下软骨细胞的影响

目的观察低强度脉冲超声(LIPUS)通过整合素-黏着斑激酶(FAK)-p38丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)通路对膝关节脂肪垫共培养下软骨细胞的影响。 方法24例女性膝脂肪垫及膝关节软骨均由骨科手术室提供,年龄25～35岁,均为膝关节急性外伤手术患者,排除其他膝关节病史。切取脂肪垫行苏木精-伊红染色(HE);制作脂肪垫培养液(FCM);于表面完好部分提取正常软骨细胞进行体外培养,按随机数字表法分成对照组、模型组（正常软骨细胞+FCM）、治疗组（正常软骨细胞＋FCM＋LIPUS干预）和抑制剂组（正常软骨细胞＋FCM＋LIPUS＋整合素抑制剂GRGDSP干预）。采用Ⅱ型胶原(COL2)免疫细胞化学染色法比较并鉴定对照组与模型组的软骨细胞。治疗组和抑制剂组接受LIPUS辐射,LIPUS辐射强度为40mW/cm2,每次辐射20min,每日1次,每周6d;其余各组接受LIPUS假辐射。第6天收集各组细胞,应用免疫印迹(Western blot)技术检测软骨细胞中Ⅱ型胶原、蛋白多糖(Acan)、基质金属蛋白酶(MMP)-13、整合素β1、磷酸化FAK(p-FAK)、磷酸化p38(p-p38)的蛋白含量。 结果免疫细胞化学染色显示,模型组软骨细胞表达的COL2免疫反应物显著少于对照组。Western blot检测显示,模型组COL2、Acan蛋白含量［(0.16±0.04)、(0.12±0.02)］较对照组［(0.55±0.03)、(0.62±0.03)］降低,MMP-13、整合素β1、p-FAK和p-p38蛋白含量［(0.49±0.04)、(0.34±0.04)、(0.33±0.05)和(0.51±0.04)］较对照组［(0.07±0.02)、(0.13±0.03)、(0.16±0.04)和(0.10±0.03)］增高,且组间差异均有统计学意义(P<0.05)。与模型组相比,治疗组COL2、Acan、整合素β1和p-FAK蛋白含量［(0.42±0.07)、(0.50±0.07)、(0.74±0.06)和(0.64±0.07)］增高,而MMP-13、p-p38蛋白含量［(0.37±0.06)、(0.37±0.08)］下降,差异有统计学意义(P<0.05);而抑制剂组COL2、Acan、MMP-13、整合素β1、p-FAK和p-p38蛋白含量［(0.19±0.04)、(0.09±0.03)、(0.51±0.03)、(0.33±0.02)、(0.30±0.05)和(0.53±0.04)］无明显变化,差异无统计学意义(P>0.05),但与对照组和治疗组相比,差异有统计学意义(P<0.05)。 结论LIPUS可通过整合素β1-FAK-p38 MAPK通路抑制脂肪因子诱导的软骨细胞MMP-13增高,减少COL2、Acan降解,从而对膝关节脂肪垫共培养下的软骨细胞起一定的保护作用。     

应用吡格列酮抑制大鼠血管移植物慢性病变

目的 研究吡格列酮对血管移植物慢性病变的影响,并探讨其作用机理.方法 制备大鼠腹主动脉移植模型.实验组以Wistar大鼠为供者,SD大鼠为受者,进行腹主动脉移植,术后采用吡格列酮(0.04 g/kg)灌胃8周;同种移植对照组以Wistar大鼠为供者,SD大鼠为受者,进行腹主动脉移植.术后采用牛理盐水灌胃8周;同系移植对照组的供、受者均为SD大鼠,术后采用生理盐水灌胃8周.移植后第8周,取移植腹主动脉段,行HE染色,显微镜F观察组织形态学变化,测量内膜厚度与中膜厚度的比值;采用免疫组织化学法测定移植动脉绀织中细胞问粘附分子-1(ICAM-1)的表达;采用双抗体夹心酶联免疫吸附试验检测血清血小板衍生生长因子(PDGF)浓度.结果 移植后第8周,同系移植对照组的血管内膜无明显变化,同种移植对照组和实验组移植血管组织均呈现出典型的移植相关血管硬化,内膜呈弥漫性向心性显著增生,管腔狭窄,新生内膜见较多血管平滑肌细胞增生,大量成纤维细胞增生,内膜可见少量单核细胞浸润;中膜变薄,内弹力纤维有断裂;外膜见大量单个核细胞,同种移植对照组的病理改变较实验组更加明显.同种移植对照组内膜厚度/中膜厚度比值为1.4140±0.2232,实验组为0.4010±0.0910,二者比较,差异有统计学意义(P＜0.01).同种移植对照组ICAM-1阳性细胞数为(26.114±1.493)个,实验组为(8.943±1.061)个,二者比较,差异有统计学意义(P＜0.01).同种移植对照组的血清PDGF含量为(1023±27)pg/ml,实验组为(265±100)pg/ml,二者比较,差异有统计学意义(P＜0.01).结论 吡格列酮能够延缓移植动脉慢性血管病变的发展,这种作用可能与局部ICAM-1表达下调、血清PDGF浓度下降有关.     

雄甾-4-烯-3,17-二酮Reformasky反应的试探

利用丰富的天然甾醇资源,经微生物切除17-位边链,能以较好的收率得到雄甾-4-烯-3,17-二酮(4-AD,1)或雄甾-1,4-二烯-3,17-二酮(ADD),因此应用这两个重要中间体合成各种甾体的化学工作受到普遍关注。以4-AD 或 ADD 为原料合成皮质激素的关键是研究一种有效的、适合于工业生产     

速尿生产工艺成品缩合方法的改进

速尿(furosemide,1)是对心脏性及肾性水肿和肝硬变引起的腹水有效,并能促进上部尿道结石排出的利尿药。现行生产工艺最后一步缩合反应系用2,4-二氯-5-氨磺酰苯     

冬虫夏草提取物对混合淋巴细胞培养体系Treg/Th17轴的影响

目的观察冬虫夏草提取物对混合淋巴细胞(MLC)培养体系Treg/Th17轴的影响,探讨冬虫夏草提取物的免疫调节机制。方法体外建立单向混合淋巴细胞培养体系,用冬虫夏草提取物干预培养体系,在不同的时间点收集细胞,采用流式细胞术检测细胞中辅助性T细胞17(Th17细胞)和CD4+CD25+T调节性T淋巴细胞(Treg细胞)的比例,并计算出Th17细胞与Treg细胞的比值;采用酶联免疫吸附试验法分别检测培养液白细胞介素(IL)-17、IL-23、IL-2和IL-6的浓度。结果冬虫夏草提取物干预组12、24、36h三个时间点T细胞中Treg细胞比例分别为(13.17±1.25)%、(12.3±1.31)%、(11.89±1.46)%,同时间点对照组T细胞Treg细胞比例分别为(11.04±1.32)%、(10.16±1.15)%、(8.91±0.97)%,差异均有统计学意义(P0.05);干预组T细胞中Th17细胞比例分别为(2.81±0.13)%、(4.02±0.38)%、(4.95±0.49)%,同时间点的对照组T细胞中Th17细胞比例分别为(4.65±0.31)%、(6.63±0.63)%、(8.03±0.76)%,差异均有统计学意义(P0.05)。冬虫夏草提取物干预组12、24、36h三个时间点T细胞中Th17细胞与Treg细胞的比例均显著低于同时间点的对照组(P0.05)。冬虫夏草提取物干预组12、24、36h三个时间点培养液IL-2水平明显高于同时间点对照组(P0.05),而干预组培养液IL-6、IL-17、IL-23水平低于同时间点的对照组(P0.05)。结论冬虫夏草提取物能够明显促进MLC体系细胞中Treg细胞增殖,抑制Thl7细胞增殖,降低Th17/Treg细胞比值,改变Th17/Treg轴的平衡,同时增加IL-2分泌、减少IL-6、IL-17、IL-23分泌,有利于诱导免疫耐受。