禽源H3N2流感病毒NA基因G170R突变对奥司他韦耐药性的分析北大核心CSCD

目的探讨H3N2小鼠适应株NA基因G170R突变,对奥司他韦是否具有耐药性。方法在小鼠鼻内接种病毒前后分别给小鼠灌胃奥司他韦,分为预防治疗组,治疗组,病毒感染对照组,空白对照组。观察小鼠体重变化情况及死亡情况,每三日各组取肺组织,测定肺组织病毒滴度。结果预防治疗组和治疗组的小鼠在鼻内接种病毒后体重都有所下降,但在感染后期小鼠体重都升高并且无死亡;病毒感染对照组小鼠在鼻内接种病毒后体重迅速下降,直至第8 d小鼠全部死亡。病毒感染对照组小鼠肺病毒滴度比预防治疗组和治疗组小鼠肺病毒滴度高,且到实验第8 d,病毒感染对照组小鼠全部死亡,而预防治疗组小鼠和治疗组小鼠肺病毒滴度都在检测值以下。结论 NA基因G170R突变的H3N2小鼠适应株对奥司他韦暂无耐药作用。     

狂犬病疫苗免疫人B细胞受体库的高通量测序分析北大核心CSCD

目的对志愿者接种商业化狂犬病病毒疫苗前后的B细胞受体库进行高通量测序,探讨志愿者接种前后B细胞受体库互补决定区3表达谱的变化情况,为了解B细胞生物学作用、评估疫苗作用等提供参考。方法以商业化狂犬病病毒疫苗分别注射4个志愿者,分离外周血单核细胞,提取PBMC总RNA,对总RNA进行逆转录获得cDNA,以cDNA为模板进行多重PCR,后通过Illumina HiseqtmXten(novaseq)平台进行高通量测序和生物信息学分析。结果通过接种RABV疫苗,志愿者BCR的多样性改变但变化无统计学意义。V/J区基因片段的序列使用频率以及V-J基因组合改变,其中IGHJ1基因与IGHV1-3、IGHV3-20、IGVH3-7和IGHV2-26使用频率升高,免疫前后差异有统计学意义;8个V-J组合在免疫前后差异有统计学意义。鉴定了疫苗免疫诱导B细胞克隆后高频扩增(>0.4%)的CDR3氨基酸克隆序列与核苷酸克隆序列,发现同一志愿者中,接种疫苗后与接种疫苗前相比高频克隆序列的大部分频率发生变化,并且不同志愿者之间的序列不同;此外还了解高频序列和对应多肽的性质,如等电点和平均亲水性。结论通过高通量测序对狂犬病病毒疫苗免疫后的人BCR进行了定量分析,发现了狂犬病疫苗免疫人后BCR表达谱的变化情况,为了解B细胞在保护宿主免受RABV感染和改善疫苗反应的生物学作用提供实验性数据。     

H5与H7亚型流感流行株嵌合病毒株的拯救及初步鉴定北大核心CSCD

目的探讨H5与H7亚型流感流行株嵌合病毒的拯救并进行鉴定,为新型流感疫苗的研发奠定基础。方法采用脂质体转染的方法,首先依照A型流感病毒A/PR/8/34 HA嵌合片段的设计对H5 2.3.4.4谱系HA和H7亚型的HA进行改造,利用反向遗传技术拯救A/B型嵌合减毒株,对拯救成功的病毒株进行形态学和分子生物学鉴定,并测定病毒滴度;从中选择H5亚型嵌合减毒株以10~4EID_(50)/50μl的剂量滴鼻感染BALB/c小鼠,观察、记录小鼠的体重变化及死亡情况,并测定攻毒后第3 d及第6 d小鼠肺脏病毒复制能力。结果成功拯救出2种A/B型嵌合减毒株,分别命名为rA/B-H5-NS110和rA/B-H7-NS110,测序显示两株嵌合减毒株的序列与预期一致,并在电镜下观察到了流感病毒样粒子。rA/B-H5-NS110和rA/B-H7-NS110株在MDCK细胞上的病毒滴度均为10^(4.50)TCID_(50)/ml;在鸡胚上的病毒滴度rA/B-H5-NS110为10^(5.25)EID_(50)/ml,rA/B-H7-NS110株为10^(5.44)EID_(50)/ml。小鼠致病性实验中H5亚型嵌合病毒感染组小鼠与对照组相比体重无明显下降,攻毒后小鼠存活率100%;攻毒后第3 d可在小鼠肺脏内检测到嵌合减毒株rA/B-H5-NS110的轻微复制,第6 d时未检测到病毒复制。结论成功地拯救出2株包含有H5 2.3.4.4谱系HA基因以及H7N9流感病毒HA基因的嵌合减毒株,为B型流感病毒包装机制的研究以及新型流感疫苗的研发提供了新的思路。     

流感病毒动物感染模型及其应用

流感病毒动物感染模型是研究流感病毒致病性、传播性和宿主抗病毒免疫机制的基础。目前已有多种动物用于流感病毒研究,主要包括小鼠、雪貂和猕猴等。本文介绍了目前已经建立的流感病毒动物感染模型及其应用,为流感病毒的防控工作提供借鉴。     

H6亚型流感病毒在小鼠肺内的适应性传代研究

目的为了进一步探讨H6亚型禽流感病毒(AIV)对哺乳动物的感染与致病能力,建立H6亚型AIV哺乳动物感染模型。方法用H6N1亚型AIV感染BALB/c小鼠,并在小鼠肺组织中连续传代,测定病毒的EID50。观察感染鼠临床症状和体征,评价病毒的致病性。结果经8～9代的适应后,该病毒即对小鼠产生明显的致病性,小鼠表现出精神萎靡、食欲减退、竖毛、弓背等临床症状。测定鼠肺适应株病毒H6N1-P8-M1、H6N1-P9-M2、H6N1-P8-M3的EID50分别为108.5、106.75和108.25/ml,三毒株感染鼠在发作期全部死亡。H6N1-P0组小鼠感染后14d仍全部存活。结论 H6N1亚型AIV与其他亚型相似,同样具有经适应后对哺乳动物呈现高致病性的能力,提示应关注H6亚型AIV对人类的潜在风险,得到的毒力增强鼠肺适应株为H6N1流感病毒疫苗和药物研究以及致病分子机制研究提供了动物模型。     

天然免疫屏障-血脑屏障调节的研究进展

天然免疫是人和动物免疫系统的重要组成部分,在抗感染过程中发挥关键作用,其中,血脑屏障是保护脑器官的天然卫士,能够阻止病原体和有害物质从血液进入脑组织和脑脊液,从而保护中枢神经系统稳定.血脑屏障通透性并非恒定不变,受到紧密连接和多种因子调控.本文综述了血脑屏障调节研究的进展.     

SCARB2蛋白提高人肠道病毒71型对转基因小鼠的感染力

目的 细胞实验证实人清道夫受体B2（hSCARB2）是人类EV71的受体,本研究拟通过建立人SCARB2转基因小鼠,建立感染能力更高的小鼠模型.方法 构建CMV启动子的SCARB2转基因表达载体,通过显微注射法建立C57BL/6J背景的人SCARB2转基因小鼠,PCR筛选阳性首建鼠.通过Western Blot和免疫组化检测目的 蛋白在各组织中的表达.EV71感染转基因小鼠后,通过实时荧光定量PCR和免疫组化检测目的 蛋白表达对病毒感染的促进效果.结果 人SCARB2蛋白主要在转基因小鼠的骨骼肌和脑组织中表达,与野生型小鼠相比,转基因小鼠组织中的病毒载量显著提高4到5倍.结论 人SCARB2的体内表达可促进EV71对转基因小鼠的感染,该蛋白在体内具有EV71受体功能.     

布鲁菌分子分型方法应用研究进展

布鲁菌属细菌是布病的病原菌。当前,用于布鲁菌属细菌分型的方法有多种,而布鲁菌分子分型方法在布病的分子流行病学调查、病原菌的快速分型鉴定、病原菌的溯源分析和菌株之间差异关系的分析过程中被广泛应用并具有十分重要的作用。本文就常用的布鲁菌的核酸探针技术(DNA probes)、聚合酶链式反应(PCR)、实时定量PCR(Real-time PCR)、16SrDNA鉴定、PCR限制性片段长度多态性( PCR-RFLP)、单核苷酸多态性分析(SNP)、脉冲场凝胶电泳(PFGE)、多位点序列分型(MLST)、多位点串联重复序列分析(VNTR/MLVA)等分子分型方法的应用研究进展予以综述。     

TaqMan 探针荧光定量PCR支原体快速检测方法的建立及应用

目的： 在支原体16SrRNA的种属特异性区域设计一对引物及其相应的Taqman探针,建立荧光定量PCR方法,检测细胞培养物中支原体。方法：选择16srRNA支原体种属特异性区域作为扩增区,设计支原体通用引物,PCR扩增片段的预期大小为288 bp。回收PCR扩增产物,连接pMD-18T载体,转化JM109大肠杆菌,涂布Amp+琼脂平板,挑取阳性克隆进行PCR鉴定后提取质粒。构建荧光定量PCR绝对定量的标准品,设计荧光定量引物、探针,采用矩阵法对反应体系进行优化,建立绝对定量的标准曲线。利用十倍稀释法检验灵敏度并与普通PCR法及培养法进行比较;对支原体及其他5种革兰氏阳性杆菌进行特异性检验;对培养法、普通PCR法及荧光定量PCR法检测样本的灵敏度进行比较。结果：支原体PCR产物大小约为288 bp,质粒质量浓度为13.9 mg/L,A260/Ａ280 (Ratio)为1
.780,质粒溶液浓度为4.25×109拷贝/ μL。10 μmol/L的引物浓度和10 μmol/L-1探针浓度为最佳反应浓度,双温循环及60℃退火温度为最佳的循环条件。检测灵敏度为4.250×101 拷贝。拷贝数与Ct值之间的线性关系表达式：Ct= －2.916×log拷贝数+40.02。特异性检验中5种革兰氏阳性杆菌样本检测均为阴性,支原体样本为阳性,表明特异性好。准确性检测中变异系数小,表明稳定性好。组内及组间相同浓度样本检测具有相同的Ct值,表明重现性好。样本检验中,荧光定量PCR检测出的阳性样本高于普通PCR及培养法。结论：支原体荧光定量PCR法检测细胞样本及临床样本中支原体快速、特异性强、灵敏度高、稳定性好。     

中东呼吸综合征冠状病毒量子点免疫层析试纸的制备

目的制备一种能快速检测中东呼吸综合征冠状病毒(MERS-CoV)的量子点免疫层析试纸,以期用于MERSCoV感染检测。方法采用EDC偶联法将羧基化CdTe/ZnSe量子点与抗MERS-CoV RBD的单克隆抗体(mAb/MERS-CoV)共价偶联,通过斑点免疫印迹检验偶联物的活性。以CdTe/ZnSe量子点标记的mAb/MERS-CoV作为荧光标记物,采用免疫层析技术制备量子点免疫层析试纸,用于MERS-CoV检测。并对该方法进行特异性、敏感性评价。结果 CdTe/ZnSe量子点可偶联mAb/MERS-CoV,且偶联物具有良好的生物活性。以其作为荧光标记物建立的量子点免疫层析试纸可特异性检测MERS-CoV假病毒,最低检测限为2×53 TCID50/ml,其他对照病毒检测均阴性。结论制备的MERS-CoV量子点免疫层析试纸具有简便、快速、特异等优点,可用于MERS-CoV感染快速诊断和流行病学调查。