狂犬病毒胶体金检测试纸的制备及初步应用

目的利用胶体金免疫层析技术建立一种快速、简便、特异的狂犬病毒检测方法。方法采用柠檬酸三钠还原法制备胶体金标记鼠抗狂犬病毒单克隆抗体,包被于结合释放垫处,分别利用纯化的兔抗狂犬病毒多克隆抗体和羊抗鼠IgG包被检测线及质控线,组装胶体金检测试纸。结果制备的狂犬病毒胶体金试纸对15个接种狂犬病毒乳鼠脑组织的检测均为阳性,与FAT结果一致;对犬瘟热病毒、犬细小病毒及犬冠状病毒细胞培养液及9个狂犬病毒阴性乳鼠脑处理液的检测均为阴性。结论用制备的狂犬病毒胶体金试纸检测狂犬病毒快速、简便、特异,具有良好的临床应用前景。     

人SCARB2蛋白提高人肠道病毒71型对转基因小鼠的感染力

目的细胞实验证实人清道夫受体B2(hSCARB2)是人类EV71的受体,本研究拟通过建立人SCARB2转基因小鼠,建立感染能力更高的小鼠模型。方法构建CMV启动子的SCARB2转基因表达载体,通过显微注射法建立C57BL/6J背景的人SCARB2转基因小鼠,PCR筛选阳性首建鼠。通过Western Blot和免疫组化检测目的蛋白在各组织中的表达。EV71感染转基因小鼠后,通过实时荧光定量PCR和免疫组化检测目的蛋白表达对病毒感染的促进效果。结果人SCARB2蛋白主要在转基因小鼠的骨骼肌和脑组织中表达,与野生型小鼠相比,转基因小鼠组织中的病毒载量显著提高4到5倍。结论人SCARB2的体内表达可促进EV71对转基因小鼠的感染,该蛋白在体内具有EV71受体功能。     

宠物与人类健康

本文围绕宠物与人类健康主题,阐述了宠物对人类健康的积极作用;宠物对人类健康的负面影响,并对保障我国宠物业健康发展提出建议.     

布鲁氏菌基因组学研究进展

布鲁氏菌是一类革兰氏阴性、胞内寄生菌,缺乏经典的毒力因子,致病性不仅依靠侵袭力和内毒素,还有赖于较强的环境适应能力。目前,布鲁氏菌入侵机体和在胞内持续存在的机制尚未明确。布鲁氏菌基因组学研究不仅可全面了解布鲁氏菌的基因组成、分子进化、毒力因子以及致病机制等特点,还可以对一些致病相关基因和重要的蛋白进行预测。该研究为开发研究疫苗和新型抗生素提供分子基础,从而为构建新的有效的布病治疗和防控策略提供理论依据。本文就布鲁氏菌的基因组组成、特征,全基因组测序分析、比较基因组研究进展予以概述。     

MERS-CoV S1蛋白的表达及鉴定

目的真核表达具有天然构象的中东呼吸综合征冠状病毒(MERS-CoV)S1蛋白,并进行免疫反应性鉴定。方法以pcDNA3.1-S重组质粒为模板,PCR扩增S1基因,连接至pFastBac1质粒,构建重组质粒pFB1-S1。将pFB1-S1转化至DH10Bac感受态中,构建重组杆粒BpFB1-S1,然后转染sf9细胞获得重组杆状病毒rpFB1-S1并连续传代。将第四代rpFB1-S1接种sf9细胞后悬浮培养96h,取上清,用PEG8000浓缩并进行免疫亲和层析纯化,采用SDS-PAGE和Western blot鉴定其分子质量及免疫反应性;另取感染rpFB1-S1 48h的sf9细胞进行IFA鉴定。结果 S1基因PCR扩增产物大小为2 212bp,与预期相符。重组质粒pFB1-S1经酶切和测序分析鉴定构建正确。重组杆粒BpFB1-S1经PCR鉴定构建正确。IFA试验可见感染rpFB1-S1的sf9细胞出现特异性绿色荧光,即有目的蛋白表达。SDSPAGE显示纯化的重组S1为单一100×103(Mr)蛋白条带,Western blot检测该蛋白能被鼠抗S-RBD蛋白单克隆抗体识别。结论成功表达了具有免疫反应性的MERS-CoV S1蛋白,为MERS-CoV快速诊断方法的建立及候选疫苗的构建奠定了基础。     

苏丹型埃博拉病毒糖蛋白原核表达及抗体间接ELISA检测方法的建立

目的原核表达苏丹型埃博拉病毒(Sudan virus,SUDV)糖蛋白(GP),并作为包被抗原建立抗体间接ELISA检测方法。方法 PCR扩增SUDV GP基因片段,克隆至pET30a(+)表达载体,IPTG诱导表达SUDV GP,经HisNi柱纯化,SDS-PADE和Western blot鉴定正确的SUDV GP作为包被抗原建立SUDV抗体间接ELISA方法,并对实验条件进行优化。结果SUDV GP在大肠杆菌中以包涵体的形式表达,建立的抗体间接ELISA检测方法最佳SUDV GP包被量为2μg/孔,待检血清最佳稀释度为1∶320,最佳作用时间1.5h,HRP标记羊抗鼠IgG最佳稀释度1∶10 000,TMB最佳显色时间为7min。该方法的特异性强,样品检测结果与已知血清的符合率为100%,检测SUDV阳性血清的敏感度为1∶40 960,SUDV GP批间及批内的实验结果变异系数(CV)均小于10%。结论成功表达SUDV GP并建立SUDV抗体间接ELISA检测方法,为疫苗免疫效果的评价、疫病的监测及SUDV抗体检测试剂盒的研发奠定了基础。     

荧光定量RT-PCR方法检测感染小鼠不同组织中的H5N1禽流感病毒

目的测定H5N1禽流感病毒感染小鼠各脏器组织中的病毒核酸含量,了解病毒复制与疾病进程的关系,为H5N1禽流感病毒致病机理与防治研究提供技术支持。方法利用建立的荧光定量RT-PCR法对H5N1禽流感病毒感染BALB/c小鼠的不同脏器组织中病毒核酸进行定量检测,观察H5N1禽流感病毒在不同组织中的复制情况。结果利用荧光定量RT-PCR法可从H5N1禽流感病毒感染小鼠后第3d的肺脏、脑、脾脏、肾脏和肝脏组织中检测到不同含量的病毒核酸;而在感染后4d的肺脏、脑和脾脏等组织中的病毒核酸含量开始下降;在感染后第6d,H5N1禽流感病毒核酸在肺脏和脑组织中大量存在外,其余组织中均有少量病毒核酸。结论H5N1流感病毒感染小鼠肺脏和脑组织中病毒核酸含量较高,说明病毒主要在小鼠的肺脏和脑组织中复制。由于荧光定量RT-PCR法可对感染小鼠不同脏器组织中的病毒核酸进行准确定量,可为H5N1禽流感病毒所致疾病的早期诊断、流行病学和致病机理研究提供技术支持。     

小反刍兽疫病毒西藏株血凝素蛋白和融合蛋白兔多克隆抗体的制备与初步应用北大核心CSCD

目的 对小反刍兽疫病毒(Peste des petits ruminants Virus,PPRV)强毒株China/Tibet/Geg/07-30血凝素蛋白H和融合蛋白F的主要抗原表位区进行原核表达,并制备兔抗PPRV H和F蛋白多克隆抗体。方法 根据GenBank上公布的PPRV China/Tibet/Geg/07-30 (GenBank FJ905304.1)株H和F蛋白的基因序列构建重组质粒pET30a(+)-H和PGEX-4T-1-F,并将重组质粒转化至宿主菌E.coliBL21(DE3)感受态,IPTG诱导表达目的蛋白,经亲和层析纯化后与弗氏佐剂混合免疫新西兰大白兔,收集血清,制备多克隆抗体,利用间接免疫荧光(IFA)方法和酶联免疫吸附试验(ELISA)检测抗体与抗原的结合能力。结果 分别对重组质粒进行酶切,pET30a(+)-H切出约1 653 bp的PPRV H基因,PGEX-4T-1-F切出约为1 245 bp的PPRV F基因,与预期一致。经IPTG诱导后重组蛋白以包涵体的形式表达,Western blot检测原核表达的两个目的蛋白均能与标签抗体发生反应,ELISA检测原核蛋白抗原能与相应多克隆抗体相结合,间接免疫荧光试验显示兔多克隆抗体能够识别表达PPRV H蛋白的重组狂犬病病毒(rSRV9-H)和表达PPRV F蛋白的重组狂犬病病毒(rSRV9-F)。结论 利用原核表达系统成功表达出具有抗原性的PPRV China/Tibet/Geg/07-30株F和H蛋白,并制备了高特异的兔多克隆抗体,为建立针对PPRV H、F蛋白抗原的鉴定及亚单位疫苗的研究奠定了基础。     

禽源H3N2流感病毒NA基因G170R突变对奥司他韦耐药性的分析北大核心CSCD

目的探讨H3N2小鼠适应株NA基因G170R突变,对奥司他韦是否具有耐药性。方法在小鼠鼻内接种病毒前后分别给小鼠灌胃奥司他韦,分为预防治疗组,治疗组,病毒感染对照组,空白对照组。观察小鼠体重变化情况及死亡情况,每三日各组取肺组织,测定肺组织病毒滴度。结果预防治疗组和治疗组的小鼠在鼻内接种病毒后体重都有所下降,但在感染后期小鼠体重都升高并且无死亡;病毒感染对照组小鼠在鼻内接种病毒后体重迅速下降,直至第8 d小鼠全部死亡。病毒感染对照组小鼠肺病毒滴度比预防治疗组和治疗组小鼠肺病毒滴度高,且到实验第8 d,病毒感染对照组小鼠全部死亡,而预防治疗组小鼠和治疗组小鼠肺病毒滴度都在检测值以下。结论 NA基因G170R突变的H3N2小鼠适应株对奥司他韦暂无耐药作用。