冷冻保存血清对HBV-DNA荧光定量PCR检测结果的影响

目的研究荧光定量PCR检测一年内冷冻保存(-80℃)血清中HBV-DNA的结果与冷冻保存时间的相关性。方法采集25例乙型肝炎患者血清标本,将其分成4份于-80℃保存,分别在第0、2、6、12月相同条件下冻融,再进行HBV-DNA荧光定量PCR检测。将检测数据转化成对数值,采用分析软件处理数据。结果 25份血清标本HBV-DNA初始值为103~107copies/ml,2个月冷冻保存的血清各组标本HBV-DNA含量较初始值没有明显差异(P=0.39);但在冷冻保存6个月和12个月后HBV-DNA含量显著低于初始值(P=0.01,P=0.00);6个月冷冻保存也明显低于2个月保存HBV-DNA含量(P=0.014)。一元线性回归分析显示,HBV-NDA检测的含量与时间成负相关(r=0.985)。结论冷冻保存(-80℃)血清时间越长HBV-DNA含量随之越低。     

紫草素对人共刺激细胞杀伤胃癌细胞的影响及其机制

目的:观察紫草素作用前后对人共刺激细胞的增殖及对胃癌细胞NCI-N87、BGC-823、HGC-27杀伤活性的影响,并探讨其作用机制.方法:分离健康者外周血单个核细胞,在体外经CD3单克隆抗体(CD3 monoclon antibody,CD3 mAb)、白介素2(interleukin-2,IL-2)、干扰素γ(interferon-γ,IFN-γ)、白介素1α(interleukin-1α,IL-1α)、CD28 mAb、IL-15和IL-21共同诱导为人共刺激细胞,予不同浓度紫草素诱导人共刺激细胞和3株胃癌细胞24、48、72 h后,水溶性四唑盐(cell counting kit-8,CCK8)法检测人共刺激细胞增殖率,四甲基偶氮唑蓝(colorimetric methyl thiazolyl tetrazolium,MTT)法检测胃癌细胞的抑制率,流式细胞术(flow cytometry,FCM)检测人共刺激细胞颗粒酶B(granzyme B,GraB)、穿孔素(perforin,PFP)、CD107a、IFN-γ的表达,Western blot检测人共刺激细胞β-catenin、P-ERK1/2、P-AKT和Bcl-2的表达,乳酸脱氢酶释放法(lactate dehydrogenase,LDH)检测紫草素对人共刺激细胞杀伤3株胃癌细胞的活性影响.结果:经紫草素诱导48 h后,人共刺激细胞0.2-50μg/L浓度组增殖明显(P<0.05),6-25μg/L浓度组GraB、PFP、CD107a、IFN-γ和β-catenin、p-ERKl/2、Bcl-2、P-AKT的表达显著高于对照组(P<0.05),且对NCI-N87、BGC-823、HGC-27的杀伤活性较对照组增强(P<0.05).结论:紫草素在一定浓度范围内能够促进人共刺激细胞增殖,并增强其对胃癌细胞NCI-N87、BGC-823、HGC-27的杀伤活性,其机制可能与活化β-catenin、P-ERKl/2、B c l-2、P-A K T和P F P、G r a B、C D107a、IFN-γ的表达有关.     

一种体外扩增γδT细胞的新方法

目的:建立一种新的γδT细胞扩增方法。方法:从健康人外周血中分离外周血单个核细胞(PBMCs),与用唑来膦酸预处理过的未成熟DCs按10:1混合,在含IL-2 400 U/ml和10%小牛血清的RPMI1640培养基中培养,用MTT法测定细胞增殖倍数。用流式细胞仪对γδT细胞进行表型分析并检测其细胞内的颗粒酶B、穿孔素和CD107a含量。用乳酸脱氢酶释放法(LDH)检测细胞杀伤活性。结果:经唑来膦酸预处理的树突状细胞与自身外周血单个核细胞共培养,到11天时γδT细胞增殖倍数达到(120±15)倍,第8天和11天γδT细胞百分率分别达到70.26%±3.56%、90.11%±4.67%。γδT细胞细胞内颗粒酶B、穿孔素及CD107a在第8天时分别为81.66%±4.32%、86.62%±5.21%和80.12%±3.78%,均高于对照组。培养的γδT细胞对SGC-7901、SW-1990、SW-480肿瘤细胞株杀伤活性至第8天时达到峰值。结论:此法能有效诱导γδT细胞体外扩增,培养的γδT细胞颗粒酶B、穿孔素及CD107a均显著高于对照组,并有较强的抗肿瘤活性。     

毒胡萝卜素对胃癌BCG-823细胞凋亡的影响

目的 探讨毒胡萝 卜素对胃癌BCG-823细胞凋亡的影响及机制研究.方法 体外培养BCG-823细胞,分别经不同浓度的毒胡萝 卜素(0.00、0.75、1.50、3.00、6.00、12.00 μmol/L)诱导培养24 h和48 h.采用CCK-8法检测毒胡萝 卜素对BCG-823细胞活力的影响和计算生长抑制率;流式...     

抗CD28单抗和IL-15对CIK增殖和杀肿瘤作用的研究

CIK是肿瘤过继性细胞免疫治疗中的免疫效应细胞。为使CIK在实验室里能被更有效地诱导增殖并赋予其更强的杀肿瘤效应,我们在CIK常规培养环境中加入抗CD28单抗和IL-15,探讨抗CD28单抗和IL-15对CIK增殖和杀肿瘤效应。取人外周血单个核细胞(PBMC),预先以常规方法诱导CIK,然后加入抗CD28单抗和IL-15与CIK共培养。用全自动五分类血液分析仪计数CIK增殖率;用流式细胞术测定CIK中粒酶B、穿孔素和CD107a等分子的表达率;用ELISA方法检测CIK分泌IL-10、IL-12、INF-γ和TNF-α水平;用乳酸脱氢酶释放法测定CIK对人肺癌细胞株(A549)、乳腺腺癌细胞株(MFC-7)和人黑素瘤细胞株(HME1)的杀伤活性。PBMC经常规CIK诱导培养以后再加入抗CD28单抗和IL-15与对照组比较,前者细胞增殖率明显增强(P<0.05);在CIK培养体系中加入抗CD28单抗和IL-15可促进颗粒酶B、穿孔素和CD107a等分子的表达率进一步增强(P<0.05);加入抗CD28单抗和IL-15,培养8d后CIK对A549、MFC-7和HME1细胞杀伤活性分别为82.2%、59.3%和70.6%,与对照组(分别为60.9%、49.6%和48.4%)相比差异有统计学意义(P<0.05);在培养体系中加入抗CD28单抗和IL-15,培养8d后其细胞因子IFN-γ、TNF-α分泌水平显著高于对照组(P<0.05),组间IL-10和IL-12的分泌量未见显著差异(P>0.05)。实验说明在CIK培养体系中加入抗CD28单抗和IL-15可增加CIK增殖率并提高其抗肿瘤效应。     

自身γδT细胞的体外培养鉴定和治疗慢性乙型肝炎的临床观察

目的探讨采用异戊烯焦磷酸（IPP）刺激人外周血单个核细胞（PBMCs）特异性扩增γδT细胞,观察其在体外对HBV复制和HBeA异表达的影响,并评估应用18T细胞过继回输治疗乙型肝炎的疗效。方法在体外应用IPP和IL-2刺激培养人外周血PBMCs8天,采用流式细胞术检测18T细胞百分率及细胞表面穿孔素、粒酶B、NKG2D和CD44表达量;采用ELISA法检测培养上清IFN-γ、TNF-α 和IL-12含量;将18T细胞与HepG2215细胞按比例共孵育后,检测上清HBeAg和HBVDNA水平。将培养成功的18T细胞回输治疗慢性乙型肝炎患者50例,12个月后观察疗效。结果人外周血PBMC8在培养前78T细胞数占5．12％,CD44表达5．13％。在培养8天后则分别升至91．27％和94．00％;18T细胞表面穿孔素、粒酶B、NKG2D受体表达量（分别为57．1％、71．6％和71．7％）明显高于培养前（分别为0．2％、1．1％和1．3％）;γδT细胞分泌IFN-γ和IL-12量明显增加;扩增的γδT细胞能够抑制HepG2215细胞HBV DNA复制和HBeAg的表达;18T细胞治疗慢性乙型肝炎患者,HBeAg转阴率为54．3％（25／46）,HBVDNA转阴率为66．0％（33／50）。结论乙型肝炎患者PBMC经刺激培养获得的78T细胞免疫功能增强,初步观察表明有一定的临床治疗作用。     

羽扇豆醇对胰腺癌细胞株SW1990及γδT细胞生长的影响

目的:探讨羽扇豆醇对人胰腺癌细胞SW1990及γδT细胞生长的影响.方法:采用本实验室体外扩增人外周血γδT细胞,用四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测不同浓度的羽扇豆醇在不同时间段对人γδT细胞和人胰腺癌细胞SW1990生长的影响.本实验分3组:空白对照组、溶剂对照组和实验组,时间段分24、48、72h组.结果:羽扇豆醇浓度在0.4-200μg/mL时羽扇豆醇对人胰腺癌细胞SW1990在24、48、72h各组与空白对照组和溶剂对照组相比差异有统计学意义(P<0.05).而24、48、72h3组比较差异无统计学意义.γδT细胞培养7d从扩增前的3.61%增加到80.2%,羽扇豆醇对γδT细胞在24、48、72h随浓度的增加先增值后抑制作用.24h与空白对照组和溶剂对照组比较差异无统计学意义.48、72h各组与空白对照组和溶剂对照组相比差异有统计学意义(P<0.05).结论:羽扇豆醇对人胰腺癌细胞SW1990有抑制作用,对γδT细胞随着浓度增加有先促进后抑制作用.     

细胞外信号调节激酶1/2通路抑制剂PD98059对体外培养γδT细胞增殖和杀伤功能的影响

目的探讨细胞外信号调节激酶(ERK)1/2信号通路抑制剂PD98059对体外培养人γδT细胞增殖和杀伤功能的影响。方法从健康人外周血中分离单个核细胞,加入到含有唑来膦酸和白细胞介素2的RPMI 1640完全培养基中诱导培养获得γδT细胞。用ERK1/2特异性抑制剂PD98059阻断γδT细胞ERK1/2信号通路后,用细胞计数仪测定γδT细胞增殖和细胞计数试剂盒(CCK-8)法测定杀伤能力;采用流式细胞术检测γδT细胞颗粒酶B和穿孔素的表达。计量资料组间比较采用t检验。结果培养10 d后的γδT细胞纯度达到(87.94±2.36)%。PD98059作用后的γδT细胞数低于对照组[(6.74±0.36)×105/ml vs(9.42±0.31)×105/ml],而PD98059作用后γδT细胞颗粒酶B阳性表达率[(48.89±1.31)%vs(41.58±1.58)%]、穿孔素阳性表达率[(65.92±3.29)%vs(33.49±2.83)%]、对肝癌Hep G2细胞的杀伤率[(69.28±4.96)%vs(48.34±3.01)%]均高于对照组,差异均有统计学意义(t值分别为-12.708、7.582、15.478、11.201,P值均0.001)。结论 ERK1/2特异性抑制剂PD98059阻断ERK1/2信号通路能抑制γδT细胞的增殖,但能增强γδT细胞的体外杀伤功能。     

白藜芦醇对人γδT细胞生长和杀伤功能的影响

目的探讨白藜芦醇对人外周血γδT细胞生长和杀伤功能的影响。方法用异戊烯焦磷酸法体外扩增人γδT细胞,不同浓度的白藜芦醇作用γδT细胞后,MTT法检测γδT细胞生长情况,流式细胞术检测给药前后γδT细胞杀伤功能相关标志物颗粒酶B、穿孔素和CD107a的表达。结果人外周血单核细胞(PBMC)培养10 d后,γδT细胞比例从扩增前的3.12%增至80.46%;白藜芦醇浓度为0.2～12.5μmol/L时能促进γδT细胞生长,其中以1.56μmol/L作用最明显,使细胞增殖率高出对照组约15.90%;白藜芦醇1.56μmol/L可上调γδT细胞杀伤功能相关标志物颗粒酶B、穿孔素、CD107a表达,随着给药浓度增高,γδT增殖及其颗粒酶B、穿孔素、CD107a表达逐渐降低。结论白藜芦醇在一定浓度范围内可促进γδT细胞增殖,且增强γδT细胞杀伤功能相关标志的表达,这可能是其抗肿瘤作用机制之一。