EB病毒潜伏膜蛋白2A基因重组逆转录病毒载体和稳定表达细胞株的构建及鉴定

目的:克隆EB病毒(EBV)潜伏膜蛋白2A(LMP2A)全长基因, 并构建含有该目的基因的重组逆转录病毒载体pGEZ-LMP2A, 转染真核细胞后获得稳定表达LMP2A的细胞株.方法:采用RT-PCR技术从B95.8细胞中获得EB病毒LMP2A全长基因, 克隆到测序载体pMD18-T中, 经测序后再亚克隆到逆转录病毒载体pGEZ-Term中, 与两辅助病毒载体PHIT456、 PHIT60通过Lipofectamine2000共转染包装细胞293T, 测定产生的重组逆转录病毒滴度并感染小鼠成纤维细胞L929, 经Zeocine筛选后得到稳定的细胞克隆, 用RT-PCR和Western blot法检测细胞中LMP2A mRNA和蛋白表达情况.结果:重组逆转录病毒载体pGEZ-LMP2A经测序鉴定正确;转染后上清中病毒的滴度为5×108 cfu/L, 感染L929细胞后用Zeocine筛选出稳定的细胞克隆;RT-PCR和Western blot检测结果表明筛选出的细胞克隆能稳定表达EBV-LMP2A.结论:表达EBV-LMP2A细胞株的构建为蛋白制备与纯化奠定了物质基础, 也为后续的EBV相关性疾病疫苗的研究提供了新思路.     

2007-2010年肿瘤患者感染的病原菌分布及耐药性分析

目的 了解2007-2010年南京医科大学第一附属医院血液科及肿瘤科肿瘤患者感染病原菌分布及耐药性规律,指导临床用药.方法 采用API鉴定系统鉴定细菌及真菌,纸片扩散法测定细菌药物敏感性,Rosco纸片法测定真菌对抗真菌药物敏感性;WHONET5.5软件进行统计分析.结果 2007-2010年血液科及肿瘤科肿瘤患者感染后共分离病原菌379株和237株;血液科肿瘤患者感染前3位病原菌依次为大肠埃希菌、表皮葡萄球菌、肺炎克雷伯菌,检出率分别为13.5％、11.9％、11.1％;肿瘤科肿瘤患者感染前3位病原菌依次为大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌、白色假丝酵母菌,检出率分别为19.4％、10.5％、9.7％;未发现耐万古霉素葡萄球菌,但对其他多种抗菌药物耐药;肠杆菌科细菌对亚胺培南、美罗培南、头孢哌酮/舒巴坦和哌拉西林/他唑巴坦较敏感;非发酵菌对环丙沙星和头孢哌酮/舒巴坦较敏感,但对其他抗菌药物耐药性较高.结论 血液科及肿瘤科肿瘤患者感染病原菌对多种抗菌药物耐药性较高,应引起重视,加强抗菌药物合理使用.     

后基因组时代病原微生物诊断新技术

微生物基因组研究和进展深深促进临床微生物实验室诊断新技术的发展。包括核酸杂交、核酸体外扩增和基因芯片等临床诊断新技术给临床实验室感染诊断带来一片光明。     

结核分枝杆菌mRNA在利福平快速药敏试验中的初步应用

目的　建立一种Mycobacteriumtuberculosis(结核分枝杆菌 ,MTB)mRNA快速敏感的检测方法并初步探讨其在利福平快速药敏试验中的应用。方法　用超声粉碎和Tripure试剂提取MTB总RNA ,针对α抗原 85B的特定编码序列建立MTBmRNA的RT PCR检测方法 ;观察MTB在含 1、2、4 μg/ml利福平的液体培养基中生长时 ,85BmRNA的动态改变 ,确定快速检测利福平耐药菌株的最佳药物浓度和时间点 ,比较RT PCR和快速培养法对 2 0株临床分离菌株利福平耐药性检测的差异性。结果　 85BmRNA的RT PCR最低检测下限为 10 0 0个细菌。 85BmRNA的动态结果表明 ,在 4 μg/ml利福平中培养 2 4h为最佳药物浓度和时间点。RT PCR和快速培养法对 2 0株临床菌株利福平药敏试验检测结果无显著差异 (χ2 =0 .5 ,P >0 .0 5 ) ,但前者能显著缩短药敏检测周期。结论　检测结核分枝杆菌mRNA的RT PCR方法可望应用于利福平快速药敏试验     

下呼吸道感染产ESBLs肺炎克雷伯菌基因型分析

目的了解引起下呼吸道感染产ESBLs肺炎克雷伯菌的耐药性及ESBLS和AmpC基因型，指导临床合理用药。方法收集产ESBLs肺炎克雷伯菌36株，用纸片扩散法进行药敏性试验，表型筛选法检测出同时产AmpC酶的菌株，PCR法检测ESBLs和AmpC酶的基因型。结果产ESBLs肺炎克雷伯菌对亚胺培南和美罗培南全部敏感，对所测试的其他药物最小同程度耐约。36株产ESBLs肺炎克雷伯菌中，20株扩增出CTX—M—Ⅲ群基因，15株扩增出TEM基因，SHV和OXA基因各1株，ACT-1（MIR-1）和DHA-1（DHA-2）各4株，12株细菌同时携带2种以上的基因型。结论本院下呼吸道感染患营中分离的产ESBLs肺炎克雷伯菌主要携带CTXM和TEM基因型，少数携带ACT、DHA、SHV和OXA基因型，可介导对口内酰胺类药物的耐药。本研究未对TEM和SHV基因型作进一步分析。     

分枝杆菌生长指示管的临床应用价值

目的 研究分枝杆菌生长指示管在其临床快速培养中的应用价值.方法 收集疑似或确诊结核病患者的临床标本96份,用N-乙酰半胱氨酸-氢氧化钠(NALC-NaOH)对标本消化去污处理后,分别接种BBL MGIT生长指示管和改良L-J培养基,同时沉渣涂片作抗酸染色.分析MGIT法的阳性率和平均检测周期,并与传统改良L-J法比较.结果 MGIT总标本培养阳性率28.1%,其巾涂阳标本阳性率77%、涂阴标本阳性率21.1%;标本阳性报警时间范围3～25 d,平均阳性诊断时间12.3 d,平均涂阳标本诊断时间10.4 d,平均涂阴标本诊断时间13.5 d.改良L-J法培养阳性侦测时间范围15～57 d,平均阳性侦测时问30.3 d,涂阳标本平均侦测时间21 d,涂阴标本平均阳件侦测时间36.3 d.结论 BBL MGIT生长指示管可快速检测临床分枝杆菌.     

下呼吸道感染患者支气管肺泡灌洗液定量培养及临床分析

目的：探讨下呼吸道感染患者支气管肺泡灌洗液病原菌分布及对常用抗菌药物的耐药性,为临床用药提供合理依据。方法：回顾性分析南京医科大学第一附属医院2018年下呼吸道感染患者支气管肺泡灌洗液定量分离培养结果及临床资料。结果：178例患者共分离病原菌197株,其中社区获得性肺炎（community acquired pneumonia,CAP）101 例（56.7%）,医院获得性肺炎（hospital acquired pneumonia,HAP）77 例（43.3%）,主要来源于重症监护病房（30.5%）、老年医学科（29.5%）、呼吸与危重症医学科（26.4%）。HAP病原菌以革兰阴性菌为主,占89.5%,CAP病原菌也以革兰阴性菌为主,但比例低于HAP病原菌,占77.5%。分离到的病原菌中,革兰阴性菌163株,占82.7%,排在前3位的是鲍曼不动杆菌（71株,36.0%）、铜绿假单胞菌（34株,17.3%）和肺炎克雷伯菌（28株,14.2%）;真菌21株,占10.7%,其中念珠菌属16株,曲霉菌4株,糠皮马拉色菌1株;革兰阳性菌13株,占6.6%,主要为金黄色葡萄球菌（10株,5.1%）。鲍曼不动杆菌对亚胺培南、美罗培南耐药率均为98.6%,铜绿假单胞菌对亚胺培南、美罗培南耐药率分别为29.4%、23.5%,肺炎克雷伯菌对亚胺培南、美罗培南耐药率均达57.1%。10株金黄色葡萄球共检出6株甲氧西林耐药金黄色葡萄球菌,检出率为60.0%,未检出对万古霉素、利奈唑胺耐药的金黄色葡萄球菌。结论：支气管肺泡灌洗液常见致病菌为革兰阴性杆菌,各病原菌耐药情况严重。临床应严格按照药敏结果合理用药,降低多重耐药菌肺部感染的发生率。     

抗C3d单抗制备及免疫金层析法的建立

目的 研制抗C3d单抗,建立免疫金层析法检测血浆补体片段C3d,判断补体活化情况。方法 用菊糖—C3d作抗原,免疫Balb/c小鼠,并制备杂交瘤,以羊抗C3包被酶标反应板并结合C3d为检测板,筛选分泌抗C3d单抗的杂交瘸。利用protein G柱亲和层析提取抗C3d单抗IgG和C3d结合物,进行SDS-PAGE电泳,鉴定单抗的特异性。将抗C3d单抗标以胶体金,制备免疫金层析测试余。通过在免疫金中加未标金的抗C3d单抗(游离单抗)来调整试纸条的灵敏度,并测定C3d。结果 SDS-PAGE电泳图上,出现IgG的重链、轻链、及C3d 3个条带;金标记抗C3d单抗的试条(Ⅰ)测C3d的灵敏度在6—10ng/m1,当加入0．1μg/m1游离抗C3d单抗(Ⅱ)后,灵敏度为10—15ng/m1。利用两种试条灵敏度的不同,对轻、中重型肝炎检测,结果轻型肝炎患者在纸条Ⅰ上阳性率为83．3％(25/30),纸条Ⅱ全为阴性,中重型肝炎者在纸条Ⅰ、Ⅱ的阳性率为100％(30/30)。结论 用本试验建立的免疫金层析法测定肝炎患者血浆C3d水平,可判断补体活化程度,辅助乙型肝炎轻、重分型。     

大芬戈尔德菌合并贪娈丙酸杆菌致非哺乳期乳腺炎1例

正非哺乳期乳腺炎临床表现为乳晕部感染,常伴有乳头溢液、脓肿形成,可反复发作,而病原菌的检出率较低,其中以金黄色葡萄球菌多见,而大芬戈尔德菌(Finegoldia magna)与贪婪丙酸杆菌(Propionibacterium avidum)混合感染鲜见报道。大芬戈尔德菌生长缓慢,占厌氧菌感染的5%~12%[1],可引起肺部、软组织脓肿、感染性心内膜炎[2]、置换关节及前     

ST131型产NDM-1型碳青霉烯酶大肠埃希菌的耐药机制研究

目的探讨我院首株临床分离的产NDM-1型碳青霉烯酶大肠埃希菌耐药特征及其传播机制。方法用Vitek 2Compact全自动微生物分析系统进行菌株鉴定及耐药初筛;微量肉汤稀释法和E-test试纸条检测药物最低抑菌浓度(MIC);改良Hodge试验、亚胺培南-EDTA协同试验检测金属β-内酰胺酶;PCR以及测序方法检测大肠埃希菌耐药基因;多位点序列分型(MLST)技术进行序列分型;S1-PFGE、Southern印迹杂交和质粒不相容性分型方法研究携带bla_(NDM-1)质粒的特征。结果该菌对包括亚胺培南、美罗培南和厄他培南在内的β-内酰胺类抗菌药物、左氧氟沙星、庆大霉素均耐药,对阿米卡星、替加环素以及多黏菌素B敏感。改良Hodge试验、亚胺培南-EDTA协同试验阳性;PCR扩增产物测序结果经BLAST比对后显示携带bla_(NDM-1)、bla_(CTX-M-14)和qnr S基因;MLST序列分型为ST131型;bla_(NDM-1)位于大小约为100 000 bp的IncN型质粒上,且该质粒可通过接合传播。结论新出现的产NDM-1型碳青霉烯酶大肠埃希菌为ST131型,bla_(NDM-1)基因可通过质粒传播,临床应加强监测以防止耐药菌传播。