腹腔镜肝切除术中入肝血流阻断方式的选择

目的:探讨腹腔镜肝切除术(LH)中如何选择合适的入肝血流阻断方式。方法:将53例行LH术患者分为间断性Pringle法组(A组,n=22)及区域性血流阻断法组(B组,n=31)。比较两组手术时间、术中出血量、术后肝功能指标、术后住院时间、并发症等。结果:两组患者术前一般资料比较差异无统计学意义(P>0.05),B组术中出血量高于A组(P<0.05),术后第1、3、7天A组ALT、AST水平均高于B组(P<0.05),两组术后住院时间及并发症比较差异无统计学意义(P>0.05)。结论 :区域性血流阻断法术中出血量略高于间断性Pringle法,但对肝功能的保护优于间断性Pringle法。     

Rock2对紫外线诱导肝癌细胞DNA损伤的保护作用及调节机制

背景与目的:Rock2基因在肝癌等多种恶性肿瘤中呈现高表达,本研究利用紫外线(ultraviolet,UV)诱导DNA损伤,观察Rho相关卷曲螺旋形成蛋白激酶2(Rho associated coiled coilforming protein kinase 2,Rock2)基因对肝癌细胞生存的保护作用,并探讨其可能的作用机制。方法:将特异性抑制Rock2表达的干扰质粒shRock2转染到人肝癌细胞Huh-7和HepG2中,用荧光定量PCR及蛋白质印迹法(Western blot)检测Rock2 mRNA及蛋白的表达。通过UV照射造成肝癌细胞DNA损伤模型,用MTT比色法检测肝癌细胞增殖的变化,Western blot检测细胞分裂周期素25A(cell division cycle 25A,Cdc25A)蛋白表达的变化,并用能量共振转移法检测Cdk2/Cyclin E活性的改变。结果:shRock2转染到肝癌细胞后,其mRNA及蛋白的表达均明显降低;经过UV诱导肝癌细胞DNA损伤时,Rock2低表达组肝癌细胞较Rock2正常组肝癌细胞增殖受到抑制。Western blot检测发现,UV诱导DNA损伤时抑制Rock2表达可导致肝癌细胞中Cdc25A表达进一步下降,并且Cdk2/CyclinE活性也随Cdc25A的降低而降低。结论:UV诱导肝癌细胞DNA损伤时,Rock2通过调节Cdc25A对肝癌细胞的生存起保护作用,可能为肝癌基因表达调控研究提供新的靶基因。     

Rock2对细胞周期检查点Cdc25A的调节作用

目的: 探讨肝癌细胞中Rho相关含卷曲螺旋蛋白激酶2(Rock2)对细胞周期检查点细胞分裂周期蛋白25A(Cdc25A)的调节作用。方法: Western blotting 检测51对肝癌及癌旁组织中Rock2与Cdc25A的蛋白表达情况。构建并筛选shRock2干扰质粒,稳定转染到人肝细胞癌Huh-7和HepG2细胞中,Western blotting检测Cdc25A蛋白表达变化;针对Rock2干扰序列,利用PCR定点突变技术进行碱基突变,构建Rock2突变质粒从而"恢复"Rock2表达,分析Cdc25A蛋白表达变化并用MTT法检测肝癌细胞增殖的改变。Western blotting检测Rock2稳定低表达的肝癌细胞中检查点激酶1(Chk1)和检查点激酶2(Chk2)蛋白的变化,免疫共沉淀及免疫荧光分析Rock2与Cdc25A的相互作用。结果: Rock2与Cdc25A蛋白在肝癌组织中较癌旁组织呈现高表达,而且两者呈正相关。肝癌细胞中稳定低表达Rock2后,Cdc25A蛋白表达明显下降;"恢复"Rock2表达后,Cdc25A蛋白表达增加而且肝癌细胞也出现增殖加快现象。Rock2低表达对Chk1和Chk2蛋白变化无明显影响。免疫共沉淀表明Rock2与Cdc25A直接相互作用,免疫荧光检测表明Rock2与Cdc25A存在共定位。结论: Rock2对细胞周期检查点Cdc25A起直接的正向调控作用,而且不依赖于Chk1/Chk2,可能为肝癌基因表达调控研究提供新的靶基因。     

Rho相关卷曲螺旋蛋白激酶与细胞凋亡

细胞凋亡是生命的基本现象之一,可以发生在生理或病理条件下。形态学表现为胞膜对称性丧失、染色质凝集、细胞皱缩、DNA破碎、线粒体肿胀和凋亡小体形成。它与一系列复杂的生化反应及不同基因的表达及调控、信号转导系统的正负调节密切相关。最近的研究表明,Rho相关卷曲螺旋     

首次应用反转录病毒仅感染分裂细胞特性构建hTERT驱动野生型p53基因反转录病毒载体质粒

目的:选择只感染分裂细胞的鼠源性反转录病毒载体pLHCX作为载体,构建由hTERT启动子驱动目的基因表达的载体,实现靶向性表达.方法:实验于2005-09/2006-05在江西省分子医学重点实验室完成.①实验材料:含319 bp hTERT核心启动子的phTERT-luc质粒由军事科学院郑晓飞博士惠赠,反转录病毒载体质粒pLHCX由浙江大学朱永良教授惠赠,含1.8 kb wtp53基因的质粒pCMV-Neo-BamH-wtp53由第二军医大学朱明华教授惠赠,增强型绿色荧光蛋白报告质粒pEGFP-N2和pEGFP-C1由本室保存,对照反转录病毒质粒pLHCX-CMV-EGFP前期构建完成;端粒酶阳性人大肠癌细胞SW620、HT-29,人宫颈癌细胞Hela,人肺癌细胞A549和端粒酶阴性人胚肺成纤维细胞MRC-5由本室保存.②实验方法:利用定向克隆的方法分别构建由hTERT启动子驱动EGFP的质粒pLHCX-hTERT-EGFP和驱动wtp53表达的质粒pLHCX-hTERT-wtp53.以质粒pLHCX-hTERT-EGFP和课题组前期构建的质粒pLHCX-CMV-EGFP转染端粒酶阳性的人大肠癌细胞株SW620和HT-29、人宫颈癌细胞株Hela和人肺癌细胞株A549以及端粒酶阴性的正常人肺胚成纤维细胞MRC-5.③实验评估:通过流式细胞仪测定分析转染效率,证实pLHCX-hTERT-EGFP在不同细胞中的表达特异性.运用RT-PCR和Western Blot分别检测p53 mRNA和p53蛋白在p53突变的大肠癌细胞株SW620中表达.利用MTT检测质粒pLHCX-hTERT-wtp53对不同细胞的增殖抑制情况和流式细胞术检测不同细胞的凋亡情况.结果:①通过酶切证实重组质粒pLHCX-hTERT-EGFP和pLHCX-hTERT-wtp53构建成功,并通过将pLHCX-hTERT-EGFP转染SW620细胞观察到绿色荧光蛋白的表达,测序证实构建质粒中包含完整的wtp53片段.②流式细胞术检测结果证实质粒pLHCX-hTERT-EGFP处理后端粒酶阳性的SW620、Hela和A549内增强型绿色荧光蛋白表达强度明显强于端粒酶阴性的MRC-5(P < 0.05),而pLHCX-CMV-EGFP在端粒阳性和阴性的上述细胞中表达无明显差异(P > 0.05).③RT-PCR和Western Blot分别证实了p53mRNA和p53蛋白表达.④MTT检测到重组质粒对端粒酶阳性的大肠癌细胞有明显的增殖抑制作用,而对端粒酶阴性的MRC-5细胞生长无明显影响(P < 0.05).⑤流式细胞检测观察到重组质粒引起端粒酶阳性的大肠癌细胞凋亡要明显强于端粒酶阴性的MRC-5细胞(P < 0.05).结论:构建的反转录病毒载体质粒pLHCX-hTERT-EGFP在端粒酶阳性的肿瘤细胞中特异性表达;重组反转录病毒载体质粒pLHCX-hTERT-wtp53转染后对端粒酶阳性的大肠癌细胞有特异性的影响作用.     

沉默Rock2对肝癌细胞增殖及凋亡作用的研究

目的:探讨沉默Rock2基因对人肝癌细胞Huh-7和HepG2增殖和凋亡作用的影响.方法:实验分为空白对照组、干扰无意义组、转染PBS组及干扰Rock2组.将Rock2干扰质粒shRock2转染到人肝癌细胞Huh-7和HepG2中,通过实时荧光定量PCR检测Rock2 mRNA的表达水平;Western blot检测Rock2蛋白的表达水平;MTT比色法检测沉默Rock2后对Huh-7和HepG2细胞增殖抑制的影响;流式细胞术检测沉默Rock2对Huh-7和HepG2细胞周期及早期凋亡的变化.结果:将shRock2转染肝癌细胞系Huh-7和HepG2后,Rock2 mRNA以及Rock2蛋白的表达水平均明显下降.沉默Rock2表达后,MTT结果显示Huh-7和HepG2细胞较对照组细胞增殖能力明显减弱(P＜0.01);Huh-7和HepG2细胞G0/G1期细胞比例明显升高,而S期和G2/M期细胞比例明显降低,与对照组比较差异有统计学意义(P＜0.01);肝癌细胞的早期凋亡较对照组明显增加(P＜0.01).结论:沉默Rock2能明显抑制肝癌细胞系Huh-7和HepG2的增殖,并诱导其早期凋亡,提示Rock2可作为肝癌基因治疗的一个新的分子靶点.     

FAT10单核苷酸多态性与肝细胞癌发生发展的关联

目的探讨FAT10基因外显子和侧翼序列单核苷酸多态性（single-nucleotide polymorphism,SNP）与 肝细胞癌发生和临床病理的关系。方法通过DNA测序分析方法,检测254例肝癌和268例健康对照人群的FAT10基因SNPs,并比较不同基因型与肝细胞癌的发生和临床病理的的关系。采用Haploview统计软件分析研究对象的连锁不平衡和单体型。结果在肝癌组和对照组共检测到10个SNPs位点。 其中-143 A/G,-121 A/G,+3476 T/C,+3607 T/C,+3620 C/G和 +3809 G/T基因型与相应的野生型纯合子相比能明显降低肝癌发病的风险（P<0.05）,但是这些多态性位点的基因型频率与肝癌的临床表型无关（P>0.05）。进一步单体型分析发现,各变异等位基因在病例组和对照组内均存在遗传连锁不平衡现象,AATTTCG、AATCTCG、GGCTCGT和AGCTCGT为四种常见的单体型。GGCTCGT和AGCTCGT单体型可能对肝癌的发病起保护性效应（OR=0.41,95%CI:0.24~0.70,P<0.05 和OR=0.43,95% CI:0.22~0.983,P<0.05）,而AATTTCG单体型可能增加肝癌的发病风险（OR=1.64,95% CI:1.24~2.17,P<0.05）。结论本研究首次发现中国汉族人群FAT10基因外显子和侧翼序列SNPs与肝癌的易感性相关,但需要不同种族的大样本和功能研究进一步验证。     

腹腔镜与开腹Bismuth-Ⅰ型肝门胆管癌根治术的疗效分析*

目的探讨腹腔镜与开腹行Bismuth-Ⅰ肝门胆管癌根治术的的临床效果。方法回顾分析2011年1月-2017年1月在该院行开腹(24例)及腹腔镜(10例)手术治疗的34例Bismuth-Ⅰ型肝门胆管癌患者的临床资料。结果两组患者均成功行Bismuth-Ⅰ型肝门胆管癌根治术,腹腔镜组患者平均术中出血量(179.50±98.05)ml和术后平均住院时间(11.80±2.49)d,明显低于开腹组的(261.25±97.33)ml和(16.25±3.35)d,差异有统计学意义(P0.05)。腹腔镜组术后第1、3和5天的总胆红素(TBIL)分别为(102.20±45.49)、(83.57±30.66)和(45.09±18.41)mmol/L;开腹组术后第1、3和5天TBIL分别为(148.17±62.78)、(121.60±43.35)和(80.59±43.89)mmol/L,两组差异有统计学意义(P0.05)。且腹腔镜组术后淋巴结检出数(9.79±3.05)枚、术后并发症1例、切缘阳性数0例;开腹组术后淋巴结检出数(9.30±3.06)枚,术后并发症3例,切缘阳性数0例,两组差异无统计学意义(P0.05)。两组患者均获得6~18个月的随访,在随访期间两组患者均未见复发及转移。结论腹腔镜下Bismuth-Ⅰ型肝门胆管癌根治术在淋巴结清扫、术后并发症、切缘阳性率和随访期间预后等方面与开腹Bismuth-Ⅰ型肝门胆管癌根治术效果相似,且更具微创优势。因此,腹腔镜下Bismuth-Ⅰ型肝门胆管癌根治术是安全、可行的手术方式。