阿尔茨海默病患者血清LncRNA MALAT1、LncRNA NEAT1的表达变化及临床意义

目的 分析阿尔茨海默病（AD）患者血清长链非编码RNA（LncRNA）转移相关的肺腺癌转录本1（MALAT1）、LncRNA核旁斑组装转录本1（NEAT1）的表达变化,探讨其是否参与AD炎症反应和认知功能损伤。方法 选取2018年1月—2021年1月青海大学附属医院收治的AD患者93例为AD组,选取同期该院54例体检健康者为对照组。采用实时荧光定量聚合酶链反应检测血清LncRNA MALAT1、LncRNA NEAT1的表达,酶联免疫吸附试验检测血清超敏C反应蛋白（hs-CRP）、白细胞介素-1β（IL-1β）、IL-6、肿瘤坏死因子α（TNF-α）水平,简易精神状态量表（MMSE）评估认知功能。Pearson或Spearman相关性分析AD患者血清LncRNA MALAT1、LncRNA NEAT1表达与病程、MMSE评分、炎症因子的相关性。ROC曲线分析血清炎症指标、LncRNA MALAT1、LncRNA NEAT1表达对AD的诊断价值。结果 AD组血清LncRNA MALAT1相对表达量和MMSE评分低于对照组,LncRNA NEAT1相对表达量高于对照组（P <0.05）。AD组hs-CRP、IL-1β、IL-6、TNF-α水平高于对照组（P <0.05）。Pearson或Spearman相关性分析显示,AD患者血清LncRNA MALAT1表达与MMSE评分呈正相关（r_s =0.587,P <0.05）,与hs-CRP、IL-1β、IL-6、TNF-α水平均呈负相关（r_s =-0.522、-0.601、-0.574和-0.577,均P <0.05）,LncRNA NEAT1表达与MMSE评分呈负相关（r_s =-0.593,P <0.05）,与hs-CRP、IL-1β水平、IL-6、TNF-α均呈正相关（r =0.487、0.588、0.611和0.573,均P <0.05）。ROC曲线显示,血清LncRNA MALAT1诊断AD的AUC为0.915（95% CI：0.858,0.955）,最佳临界值为0.98,其对应的敏感性为94.62%（95% CI：87.92,98.22）,特异性为81.48%（95% CI：68.61,90.70）;血清LncRNA NEAT1诊断AD的AUC为0.858（95% CI：0.791,0.910）,最佳临界值为2.37,其对应的敏感性为90.32%（95% CI：82.45,95.52）,特异性为72.22%（95% CI：58.44,83.57）。结论 AD患者血清LncRNA MALAT1低表达、LncRNA NEAT1高表达可能参与AD炎症反应和认知功能损伤,可作为AD的诊断标志物。     

小鼠CTLA4-Ig融合蛋白的表达、纯化及活性测定

目的:在真核细胞中表达CTLA4鄄Ig融合蛋白,获得纯品并测定其生物学活性。方法:用电转染的方法将真核表达载体pREP7鄄CTLA4鄄IgG2c转染SP2/0细胞,经300μg/ml的潮霉素筛选得到阳性克隆;大量培养后收集含有重组CTLA4鄄IgG2c的细胞培养上清,用rProteinA亲和层析柱纯化CTLA4鄄Ig。用还原和非还原性SDS鄄PAGE和蛋白印迹进行鉴定。采用单向混合淋巴细胞培养(3H掺入法)测定CT鄄LA4鄄Ig对T细胞增殖的抑制效应。结果:阳性克隆大量培养的细胞上清经rPrtoteinA亲和层析后得到纯化CTLA4鄄Ig。还原条件下SDS鄄PAGE和Westernblot的结果显示在55KD出现目的蛋白条带;在非还原条件下SDS鄄PAGE和Westernblot在130KD处出现目的蛋白条带。混合淋巴细胞培养5d的结果显示,CTLA4鄄Ig浓度为10μg/ml时可以抑制T细胞的增殖;20μg/ml时抑制达到最大程度(P<0.05);继续增加CTLA4鄄Ig的浓度,其抑制作用不再增强。3、7d时的抑制作用不明显。结论:在SP2/0中表达了小鼠CTLA4鄄Ig融合蛋白,该融合蛋白能抑制T细胞的增殖。     

人破伤风免疫噬菌体抗体库的建立及鉴定

目的：建立人破伤风免疫噬菌体抗体库，筛选抗破伤风类毒素的抗体基因，并在大肠杆菌中表达可溶性Fab段。方法：从破伤风类毒素免疫志愿者中分离淋巴细胞，提取细胞总RNA，用一组人IgG Fab基因特异性引物，从合成的cDNA中经PCR扩增出抗体轻链(VL CL)和重链Fd(VH CHl)基因，分别经Xba Ⅰ／Sac Ⅰ和Spe Ⅰ／XhoⅠ酶切克隆入噬菌粒pComb3。用破伤风外毒素作为抗原进行筛选富集获得特异性抗破伤风类毒素的噬菌体抗体，切去噬菌体外壳蛋白基因Ⅲ(gⅢ)，表达可溶性人抗破伤风类毒素的Fab段。结果：经核苷酸序列分析证实，所获得的基因为人IgGFab基因；用ELISA鉴定表明，表达的人IgGFab抗体能特异性地与破伤风外毒素结合。结论：利用噬菌体抗体库技术筛选可得到与破伤风外毒素特异性结合的人抗破伤风类毒素基因工程抗体。     

应用抑制消减杂交技术筛选颞叶癫痫的相关基因

目的 构建颞叶癫痫大鼠海马组织差异表达基因的消减cDNA 文库,筛选颞叶癫痫的差异基因。方法 采用抑制消减杂交方法,以正常大鼠和癫痫大鼠的海马组织作为对比材料,分离组织中差异表达基因的cDNA 片段,将其与T载体进行T/A连接构建文库,将连接产物转化大肠杆菌进行文库扩增后,随机挑取100个白色克隆,用菌落PCR法筛选差异基因克隆,并进行测序分析。结果 获得14个在癫痫大鼠海马组织中有差异表达,并与大鼠的已知基因片段高度同源的基因。 结论 抑制消减杂交技术是一种高效的筛选差异表达基因的方法,颞叶癫痫大鼠海马组织中存在许多差异表达基因,为深入研究癫痫发病的分子机制提供重要线索。     

人树突状细胞体外直接抑瘤作用研究

目的：诱导获得人外周血树突状细胞(DCs)，研究其体外直接抑瘤作用及机制。方法：自正常人外周血分离获得单核细胞，体外rhGM-CSF和rhIL-4联合诱导培养，观察细胞形态并检测其相关表型；利用MTT法检测所诱导DCs及其培养上清对不同肿瘤细胞系的体外直接抑瘤效应。结果：诱导5—7天后的悬浮细胞具有典型的DCs形态，流式分析显示HLA-DR表达率为64．02％，CD14表达率为2．34％；抑瘤实验显示：DCs对HT29、Hela及HepG2．2．15三种肿瘤细胞系的生长具有明显抑制，其抑制率分别为20．16％，25．44％，75．41％，而对Lovo和HepG2两种肿瘤细胞系，则无明显的抑制作用。DCs培养上清均未见明显的抑瘤效应。结论：人类DCs可对某些肿瘤细胞的生长产生直接抑制作用，但对不同的肿瘤细胞其作用不同。此作用可能由DCs与肿瘤细胞的直接接触而触发，而与DCs分泌的细胞因子关系不大。     

噬菌体展示技术在鼠CD137L活性研究中的应用

目的探讨噬菌体展示技术在鼠CD 137配体(CD 137L)活性研究中的应用。方法用PCR法扩增出鼠CD 137L胞外区,用噬菌体展示技术展示其CD 137L;EL ISA方法检测噬菌体CD 137L的抗原性,并分3次注射到大鼠体内,取血清检测大鼠体内多克隆抗体水平。结果PCR方法成功扩增出鼠CD 137L胞外区;获得重组子pCom b3H-CD 137L,成功展示在噬菌体上;噬菌体CD 137L可与抗CD 137L特异性结合;大鼠体内产生了CD 137L的多克隆抗体。结论噬菌体展示技术用于鼠CD 137L活性的研究,可提高制备特异性抗体的成功率,得到特定结构和功能的蛋白质。