酵母双杂交诱饵蛋白LASS1合表达质粒的构建及鉴定

目的构建酵母双杂交系统诱饵蛋白大鼠LASS1融合表达质粒，为进一步筛选大鼠脑神经元内与LASS1p相互作用的蛋白奠定基础。方法应用PCR方法获得大鼠LASS1基因2个片段，分别克隆人酵母双杂交系统诱饵蛋白质粒载体pGBKT7，转染酵母菌AH109并检测重组质粒的自激活现象及毒性。利用Western印迹检测重组质粒在AH109的表达情况。结果LASS1基因的PCR产物片段大小分别为Flag（111bp）、Slag（109bp）；Western印迹结果表明2个重组质粒表达的蛋白均可以与抗c-Myc抗体在22ku处特异性反应；重组质粒转化酵母后无自激活作用。结论重组质粒pGBKT7-Flag、pGBKT7-Slag均能够存AH109内正确表达，可作为酵母双杂交系统诱饵蛋白使用。     

阴道毛滴虫Rac1蛋白的cDNA克隆和序列分析

目的　获得阴道毛滴虫Rac1蛋白的cDNA克隆,研究其在细胞周期中的调解作用。　方法　提取阴道毛滴虫总RNA,构建cDNA表达文库,随机分离cDNA克隆并测序。用在线生物分析软件NCBIBLAST、ClustalW以及Treeview等程序进行序列分析。　结果　获得一株有714bp的cDNA克隆。序列分析表明,该克隆开放阅读框具600bp,推测肽链具200个氨基酸。该肽链与Rho家族中Rac1鸟苷三磷酸(GTP)酶同源性最高(>60 %),并具多种RhoGTP酶的保守基序,如GTP结合部位、GTP酶激活蛋白作用基序、GTP分离抑制因子作用基序、鸟嘌呤核苷酸交换因子作用基序等。进化树分析显示该克隆属于Rac亚家族GTP酶,与原虫Rac1蛋白最接近。　结论　该克隆属RhoGTP酶的Rac亚家族,很可能是阴道毛滴虫的Rac1蛋白。     

阴道毛滴虫沉默信息调节因子2同源基因的原核表达载体构建及表达

提取阴道毛滴虫（T.vaginalis）LX006细胞株传代培养细胞总RNA，RT-PCR扩增Tv-Sir2-like全长cDNA链，扩增产物连接到T-A克隆载体并转化大肠埃希菌（E.coli）JM109。提取重组克隆质粒，并用限制性内切酶EcoRⅠ和PstⅠ进行双酶切，将目的基因定向克隆到原核表达载体pET-41b，并在E.coli BL21中经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导表达。结果显示目的基因定向克隆于原核表达质粒pET-41b获得了表达重组子，IPTG诱导该原核表达载体在E.coli BL21中表达相对分子质量（Mr）约为59 000的重组融合蛋白，表达量占菌体总蛋白量的30%。     

阴道毛滴虫Rac1蛋白的cDNA克隆和序列分析

目的　获得阴道毛滴虫Rac1蛋白的cDNA克隆 ,研究其在细胞周期中的调解作用。　方法　提取阴道毛滴虫总RNA ,构建cDNA表达文库 ,随机分离cDNA克隆并测序。用在线生物分析软件NCBIBLAST、ClustalW以及Treeview等程序进行序列分析。　结果　获得一株有 714bp的cDNA克隆。序列分析表明 ,该克隆开放阅读框具 60 0bp ,推测肽链具 2 0 0个氨基酸。该肽链与Rho家族中Rac1鸟苷三磷酸 (GTP)酶同源性最高 (>60 % ) ,并具多种RhoGTP酶的保守基序 ,如GTP结合部位、GTP酶激活蛋白作用基序、GTP分离抑制因子作用基序、鸟嘌呤核苷酸交换因子作用基序等。进化树分析显示该克隆属于Rac亚家族GTP酶 ,与原虫Rac1蛋白最接近。　结论　该克隆属RhoGTP酶的Rac亚家族 ,很可能是阴道毛滴虫的Rac1蛋白。     

阴道毛滴虫过氧化物氧化还原酶系统的RNA干扰

目的 用干扰RNA的方法特异性降解阴道毛滴虫细胞过氧化物酶（Prx）和硫氧还蛋白还原酶（TrxR）的mRNA，并观察其对虫体生长情况的影响。 方法 取患者阴道毛滴虫培养，用酚、氯仿法提取其基因组DNA，反转录合成双链RNA（dsRNA）后用RNase Ⅲ消化过柱，合成小分子（21～23 bp）干扰RNA（siRNA）；由脂质载体介导分A、B、C等3组转染，分别降解毛滴虫细胞Prx、TrxR及Prx+TrxR，转染前的细胞作为对照组（D组）；收集转染前、转染后24 h和48 h的毛滴虫细胞，用半定量反转录-PCR（RT-PCR）检测Prx和TrxR的mRNA水平；转染36 h后显微镜下计数并观察细胞活力。 结果 转染后阴道毛滴虫Prx和TrxR的mRNA水平显著下降，组间细胞的活力差异无统计学意义（P＞0.05），但组间细胞数差异具有统计学意义（P＜0.01），4组的细胞均数：A、B、C、和D组分别为7.2×107/L、14.2×107/L、3.8×107/L和20.3×107/L。 结论 用干扰RNA的方法可以抑制Prx和TrxR的mRNA水平，对阴道毛滴虫的细胞周期有明显延长作用，而对细胞活力无明显影响。     

用核酸原位杂交技术观察细粒刺球绦虫66kDa抗原mRNA在虫体上的细胞定位

目的用核酸原位杂交技术观察细粒棘球绦虫66kDa抗原mRNA在虫体上的细胞定位以及在虫体发育的不同时期mRNA含量的变化.方法以66kDa抗原的cDNA克隆EgA31为模反制备RNA探针,与细粒棘球绦虫原头蚴、育囊和成虫虫体进行原位杂交实验.结果原位杂交实验显示EgA31 mRNA主要位于原头蚴和成虫的皮层下某种细胞中，暗藏在棘球蚴育囊的生发层中也存在这种细胞.在原头蚴向成虫的发育过程中虫体吸盘处细胞内EgA31 mRNA含量显著增加，结论含EgA31 mRNA的细胞很可能是皮层细胞EgA31蛋白可能参与吸盘上肌纤维的收缩作用并与虫体的免疫逃避功能有关.     

硒酸钠抑制铁诱导的tau过度磷酸化

目的探讨硒酸钠对过量铁诱导的tau过度磷酸化的影响及其机制。方法将人神经瘤细胞母细胞SHSY5Y细胞共设计4个不同的处理组:对照组;加入抗坏血酸;硫酸亚铁处理组:加入配置好的溶解于抗坏血酸的硫酸亚铁溶液(终浓度50μmol/L)处理24 h;硒酸钠预处理组:硒酸钠(终浓度为0.1μmol/L)预处理细胞12 h后,更换为配置好的硫酸亚铁溶液(终浓度50μmol/L)处理24 h;硒酸钠处理组:加入硒酸钠(终浓度为0.1μmol/L)预处理细胞12 h后,更换为抗坏血酸溶液处理24 h。活性氧试剂盒检测细胞氧化应激水平,免疫印迹法检测tau在Thr231、Ser396和Ser404等位点的磷酸化水平、蛋白磷酸酶2A(PP2A)和糖原合成酶激酶3β(GSK3β)的活性。结果各组细胞中总tau的表达水平无显著变化。与对照组比较,硫酸亚铁处理组tau在Thr231、Ser396和Ser404等位点的磷酸化程度分别增加了(77.40±26.62)%、(116.80±30.90)%和(78.80±26.76)%,差异有统计学意义(P0.05);相对于硫酸亚铁处理组,硒酸钠预处理显著降低了tau在Thr231、Ser396和Ser404等位点的过度磷酸化,分别降低了(51.08±13.37)%、(42.59±13.65)%和(38.42±13.80)%,差异有统计学意义(P0.05)。与对照组比较,硫酸亚铁处理的细胞中活性氧(ROS)水平显著增加至(155.4±3.79)%;与硫酸亚铁处理组比较,硒酸钠预处理的细胞中ROS水平减少了(38.70±4.52)%,差异均有统计学意义(P0.05);与对照组比较,用硒酸钠处理的细胞的ROS水平无显著变化。Western blot结果显示硒酸钠和硫酸亚铁处理未改变细胞中PP2A的表达水平,但是与对照组比较,硫酸亚铁处理的细胞中p-PP2A/PP2A的比例显著增加至(186.1±20.57)%,而与硫酸亚铁处理组比较,硒酸钠预处理组细胞中p-PP2A/PP2A的变化降低(42.89±12.05)%,差异均有统计学意义(P0.05)。另外,与对照组比较,硫酸亚铁处理组细胞中p-GSK3β/GSK3β显著降低至(62.05±3.99)%,而与硫酸亚铁处理组比较,硒酸钠预处理组的细胞中pGSK3β/GSK3β水平增加了(23.73±9.48)%,差异均有统计学意义(P0.05)。结论经过硒酸钠预处理的细胞在一定程度上抑制过量铁带来的细胞氧化应激水平、PP2A和GSK3β活性的变化,从而减少过量铁引起的tau过度磷酸化。     

H_2O_2诱导的PC12应激损伤中CR及SIRT1参与的调节效应

目的研究H2O2诱导的PC12细胞(又称肾上腺嗜铬细胞瘤细胞)氧化应激损伤中,热量限制(caloric restriction,CR)参与的调控效应及SIRT1的表达变化。方法采用MTT法检测H2O2诱导的氧化应激损伤中CR对PC12细胞活力的影响;TUNEL染色法检测各实验组中PC12细胞的凋亡;免疫荧光检测PC12细胞中SIRT1的表达与定位;RT-PCR及Wester-blot检测各实验组中SIRT1、Caspase-3的表达。结果 60μmol/LH2O2作用6h后,H2O2组细胞活力可维持在70%以上,与正常对照组及CR组比较差异具有统计学意义;而120μmol/LH2O2作用下,H2O2组细胞活力显著下降。本实验选取60μmol/LH2O2浓度作为后续实验使用浓度。CR处理后PC12细胞的凋亡率较H2O2组显著降低。PC12细胞中SIRT1可于细胞浆和细胞核中表达,且主要于细胞浆中表达。H2O2作用6h后,与正常对照组相比SIRT1表达降低,Caspase-3表达上升;在CR+H2O2组中,与H2O2组比较,Caspase-3降低,SIRT1表达上升。结论 CR具有抗应激损伤及凋亡的效应,可上调PC12细胞中SIRT1的表达,在H2O2诱导的PC12细胞应激性损伤中CR-SIRT1的调控具有保护效应。     

蛋白激酶C和JNK在溶血磷脂酸诱导人肺成纤维细胞MCP-1表达中的作用

目的：研究蛋白激酶C（PKC）和c-Jun氨基末端激酶（JNK）在溶血磷脂酸（LPA）诱导人肺成纤维细胞（HLF-1）单核细胞趋化蛋白-1（MCP-1）表达中的作用。方法：培养HLF-1细胞,以不同浓度（0、1、3和10 μmol/L）的LPA处理细胞不同时间（0.5、6、12和24 h）后,ELISA检测细胞培养基上清液中MCP-1的蛋白表达,荧光定量PCR检测MCP-1 mRNA的表达水平。用不同浓度的PKC抑制剂Bisindolylmaleimide I（0、0.1、1和10 μmol/L）或JNK抑制剂SP600125（0、0.1、1和10 μmol/L）预孵育细胞30 min后,用LPA（10 μmol/L）刺激2或6 h后,ELISA方法检测细胞培养基上清液中MCP-1的蛋白表达,荧光定量PCR检测MCP-1 mRNA的表达水平。用PKC抑制剂Bisindolylmaleimide I（1 μmol/L）预孵育30 min,以浓度为10 μmol/L的LPA处理细胞不同时间（0、5、30和60 min）后,Western blot检测c-Jun蛋白磷酸化水平。结果：LPA可诱导HLF-1细胞MCP-1蛋白释放,并呈剂量效应和时间效应关系。LPA的浓度为10 μmol/L时,HLF-1细胞释放MCP-1蛋白的量是对照组的2.4倍（P < 0.05）;细胞在LPA处理24 h后,MCP-1蛋白的释放量较对照组增加约1倍（P < 0.05）。LPA可诱导HLF-1细胞MCP-1 mRNA的表达并呈时间效应,LPA处理2 h后,MCP-1 mRNA表达水平是对照组的5.3倍（P < 0.05）。PKC抑制剂Bisindolylmaleimide I和JNK抑制剂SP600125均可显著抑制LPA诱导的HLF-1细胞MCP-1 mRNA表达及MCP-1蛋白释放。Bisindolylmaleimide I的浓度为1 μmol/L时可阻断LPA诱导的HLF-1细胞MCP-1蛋白释放量的60%（P < 0.05）,浓度为3 μmol/L时对MCP-1 mRNA表达有明显抑制效果,抑制率达40%（P < 0.05）;而SP600125的浓度为1 μmol/L时可阻断LPA诱导的HLF-1细胞MCP-1蛋白释放量的78%（P < 0.05）,对MCP-1 mRNA表达有明显抑制效果,抑制率达87%（P < 0.05）。10 μmol/L的LPA可显著诱导HLF-1细胞c-Jun磷酸化,同时PKC抑制剂Bisindolylmaleimide I（1 μmol/L）可显著抑制LPA（10 μmol/L）诱导的HLF-1细胞c-Jun磷酸化。结论：PKC与JNK通路均参与LPA诱导HLF-1细胞MCP-1的表达。     

淫羊藿甙腹腔注射对新生大鼠卵巢发育的影响

目的应用淫羊藿甙对新生大鼠进行腹腔注射,了解其对卵泡发育和卵母细胞凋亡的影响。方法用淫羊藿甙对出生后1～8d大鼠腹腔注射50mg/（kg·d）,分别取出生后2、4、8d龄卵巢,用苏木素-伊红（hematoxylin-eoxin,HE）染色观察不同发育阶段卵泡比例,末端脱氧核苷酰基转移酶介导性dUTP切口末端标记（TdT-mediated dUTP Nick-End Labeling,TUNEL）荧光染色检测卵巢内卵母细胞凋亡变化。结果在淫羊藿甙腹腔注射组的新生的鼠中,1、2d龄卵巢内未装配卵泡比例及4、8d龄卵巢内原始卵泡比例均高于对照组;各日龄组卵巢中卵母细胞TUNEL阳性率明显低于对照组。结论淫羊藿甙可能通过延缓卵母细胞巢破裂,抑制原始卵泡的发育启动,减少卵母细胞凋亡从而增加新生大鼠卵巢中卵母细胞的储备量。