构建具有突变铜-锌超氧化物歧化酶绿色荧光真核表达载体

目的:构建一个具有特殊临床表型的肌萎缩侧索硬化症家系的突变铜-锌超氧化物歧化酶与有增强绿色荧光蛋白基因的pEGFP-N1融合的真核表达载体。方法:实验于2003-09/2005-01在第三军医大学全军免疫学研究所完成。通过RT-聚合酶链扩增突变铜-锌超氧化物歧化酶cDNA,应用基因重组技术,将得到的突变铜-锌超氧化物歧化酶cDNA克隆入荧光真核表达载体pEGFP-N1中,转化DH5α感受态细胞,用含卡那霉素LB培养基平板筛选转化菌,阳性重组子经EcoRⅠ与BamHⅠ双酶切分析、测序鉴定。结果:提取到纯度较高的总RNA,通过RT-聚合酶链和基因重组得到重组质粒,应用EcoRⅠ与BamHⅠ双酶切重组质粒,得到长约130bp和4.6Kb的两条带,前者为插入片段的长度,后者为pEGFP-N1载体本身的长度。测序也最终证实重组载体的方向及序列正确。结论:突变铜-锌超氧化物歧化酶cDNA成功地亚克隆至荧光真核表达载体pEGFP-N1中,获得突变铜-锌超氧化物歧化酶/pEGFP-N1重组质粒,从而为实时监测突变铜-锌超氧化物歧化酶基因在体内的表达和蛋白定位提供一个有用的工具载体。     

新型肽-DNA复合颗粒性疫苗的制备方法

目的 研究、优化新型颗粒性肽-DNA复合疫苗的制备方法。方法以DNA沉淀试验、DNA阻滞试验、DNase Ⅰ保护试验和电镜分析对该疫苗颗粒的制备参数进行优化。结果在NaCl浓度为87．5mmol／L，电荷比为2的制备条件下，该疫苗形成直径为20nm的均一颗粒，并可有效介导DNA疫苗所携带基因的表达。结论该研究为颗粒性肽-DNA复合疫苗获得良好的免疫学效应奠定了基础。     

大鼠脾脏20S蛋白酶体的分离纯化及电镜观察

目的　分离纯化正常大鼠脾脏 2 0S蛋白酶体 ,并观察其形态特征。方法　采用分级盐析、离子交换层析及凝胶过滤方法 ,分离纯化了正常大鼠脾脏 2 0S蛋白酶体 ,并进行透射电镜观察。结果　所制备的2 0S蛋白酶体纯度较高 ,非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳 (PAGE)显示 1条带 ,SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳 (SDS PAGE)显示 8条带 ,分子量为 ( 19.8～ 31.7)× 10 3;电镜观察显示 ,脾脏 2 0S蛋白酶体呈现典型的圆筒状 ,具有同其它细胞 2 0S蛋白酶体一样的形态特征。结论　这为进一研究 2 0S蛋白酶体结构与功能的关系奠定了基础。     

脊髓背根入髓区毁损术治疗臂丛神经损伤后神经病理性疼痛的疗效及其影响因素分析(附105例报告)

目的探讨脊髓背根入髓区(DREZ)毁损术治疗臂丛神经损伤后神经病理性疼痛的疗效及其影响因素。方法回顾性分析2005年8月至2018年1月首都医科大学宣武医院功能神经外科收治的105例臂丛神经损伤后神经病理性疼痛患者的临床资料。根据患者疼痛及感觉缺失区对应的皮节,采用颈髓DREZ毁损术治疗。术后对所有患者行电话或门诊随访,随访内容为疼痛数字评分(NRS),以疼痛改善率[(术前NRS-术后NRS)/术前NRS×100%]评估患者疗效;其中改善率>75%为优秀,50%~75%为良好,≤50%为差。进一步采用单因素和多因素logistic回归分析法判断影响患者疗效的临床因素。结果105例患者的手术均成功。术后并发生症包括:手术同侧下肢麻木33例(31.4%)、下肢深感觉障碍20例(19.0%)、下肢无力9例(8.6%),手术对侧肢体麻木5例(4.8%),硬脊膜漏1例(1.0%);无一例出现切口愈合不良和感染。105例患者的随访时间为(47.3±25.5)个月(10~144个月)。至末次随访,105例患者疼痛的中位改善率(上、下四分位数)为100%(60%,100%);其中,74例(70.5%)为优秀,9例(8.6%)为良好,22例(20.9%)为差。单因素分析结果显示,性别、年龄、损伤原因、疼痛出现的时间、疼痛形式、性质及术后并发症对患者的疗效均无影响(均P>0.05),而病程和脊髓萎缩程度对疗效有影响(均P<0.05)。进一步多因素logistic回归分析结果显示,轻度脊髓萎缩是影响患者疗效的独立保护因素(OR=95.952,95%CI:4.171~2207.414,P=0.004)。结论DREZ毁损术治疗臂丛神经损伤后神经病理性疼痛疗效较好且多较持久;同时有轻度脊髓萎缩的患者手术疗效较好。     

文献阅读研讨课在医学免疫学教学中的应用

<正>《医学免疫学》是我校临床医学、预防医学、核医学、野战外科学、预防医学、医学检验、高原医学、医学影像学、医学心理学等专业学员的必修专业基础课。医学免疫学是研究免疫系统的组织结构和生理功能的科学,它从不同的角度和水平揭示免疫系统识别并消除有害生物及其成分(体外入侵、体内产生)的应答过程和规律,并应用这些规律来阐明疾病发生发展的机制,达到防治疾病的目的。免疫学是生命科学领域发展最为迅速的前沿学科之一,     

Alzheimer病Aβ1-42肽和IL-4双基因表达质粒的构建和表达鉴定

目的构建Alzheimer病Aβ1-42基因和小鼠IL-4共表达质粒,探讨其作为Alzheimer病特异疫苗的可能性.方法全基因合成Aβ1-42基因片段并克隆入pMD18-T载体中,再从Aβ1-42/pMD18-T重组质粒中切下Aβ1-42基因并克隆入TA-CE5真核双表达载体中,构建重组质粒Aβ1-42/TACE5.从pUMMV-mIL4质粒中切下mIL-4并克隆到重组质粒Aβ1-42/TACE5中,构建双表达重组质粒Aβ1-42/mIL-4/TACE5测序鉴定克隆基因的正确性.脂质体试剂Lipofectamine 2000体外转染Aβ1-42/mIL-4/TACE5重组质粒于BHK-21细胞中,用ECL-Western-blot方法鉴定mIL-4和Aβ1-42能在该细胞中共表达.结果正确构建了Aβ1-42/mIL-4/TACE5双表达重组质粒,并且在转化此质粒的BHK-21细胞中检测出了Aβ1-42和mIL-4的表达.结论 双表达重组质粒Aβ1-42/mIL-4/TACE5基本可以满足其作为Alzheimer病特异的候选DNA疫苗的要求,为下一步的基因疫苗转基因动物体内免疫学实验提供了实验依据.     

基于α-病毒复制酶的基因疫苗对人黑色素瘤的免疫作用

目的研究基于α-病毒复制酶的人黑色素瘤基因疫苗免疫学作用.方法建立及鉴定人/鼠嵌合模型(trimera),将基于α-病毒复制酶的mage-3基因疫苗免疫动物,检测动物体内特异抗体滴度;用标准4 h51Cr释放实验检测动物体内特异CTL活性.结果FACS分析显示,trimera小鼠腹腔细胞中人白细胞占总细胞的88.84%,脾脏细胞中人白细胞的比例占57%,同国外文献报道一致.基于α-病毒复制酶的重组基因疫苗mage-3/pSMART2a对trimera小鼠免疫后,小鼠腹腔细胞的CTL在效靶比为100:l时杀伤率达到70%左右,此时的对照组mage-3/pCI-neo组最大杀伤率为40%左右.ELISA结果显示,重组基因疫苗mage-3/pSMART2a组产生的mage-3抗原特异性抗体效价达到1:512,mage-3/pCI-neo组为1:256.结论成功建立了人/鼠嵌合模型,并在动物体内激发出针对人黑色素瘤基因疫苗的初次免疫应答.     

SARS-CoVS蛋白全长基因克隆及其表达的初步研究

目的：克隆表达SARS-CoVS蛋白，构建SARS全长基因疫苗。方法：从SARS病毒的总cDNA中以PCR方法扩增编码人SARS-CoV S1和S2蛋白的编码序列，再将二者分别克隆入真核表达载体pVAX1，构建重组表达载体。然后进一步将S1和S2连接到pVAX1中。酶切和测序鉴定阳性克隆。采用脂质体法转染Vero E6细胞，用Western检测S蛋白的表达。结果：PCR方法分别扩增出了1900bp和1800bp左右的基因片段，两片段插入pVAX1构建重组表达载体后，经序列测定证实该插入片段为SARS病毒S蛋白编码序列。将重组子转染Vero E6细胞，收集细胞总蛋白，Western检测获得特异蛋白带。结论：成功克隆并表达了SARS-CoVs蛋白，为其作为SARS基因疫苗研究打下基础。     

PD-L1 mAb的制备、鉴定及其特性的研究

目的制备抗程序化死亡配体-1(Programmed Death-Ligand 1,PD-L1)的mAb杂交瘤细胞系并对其分泌的抗体特性进行研究。方法用我室纯化的PD-L1／IgG4 Fc融合蛋白免疫Balb／c小鼠,取小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞SP2／0进行融合,经筛选和克隆化后,建立杂交瘤细胞系。以Western-blot等方法研究抗体特性。结果得到3株能够稳定分泌抗体,效价高的杂交瘤细胞系2D10、1C3和1A6,Western-blot显示2D10、1C3和1A6能与PD-L1(Mr为5800)结合。结论得到杂交瘤细胞系稳定分泌的mAb,在抗病毒免疫、抗肿瘤反应和自身免疫性疾病的免疫诊断和／或治疗方面可能有广阔的应用前景。     

HLA-A*0201/HPV-18E77-15五聚体的构建及其初步应用

目的构建人乳头状瘤病毒18型（HPV-18）特异性HLA-A2肽五聚体，为HPV-18型抗原特异性细胞毒性T淋巴细胞（CTL）的检测提供直接、有效的方法，并将其初步应用于宫颈癌患者外周血中抗原特异性CTL的检测。方法构建含有HLA-A2-BSP和β2M基因的原核表达载体，并进行表达、复性、鉴定及纯化。再将特异性短肽与HLA-A2-BSP和β2M在体外进行耦合，该复合物经纯化浓缩后进行生物素化。生物素化的产物经纯化浓缩后形成单体，此单体再与藻红蛋白标记的链霉亲和素按一定比例耦合构建成五聚体。运用所构建的五聚体，通过流式细胞仪检测宫颈癌患者外周血中抗原特异性CTL，并与正常对照组进行比较分析。结果所构建的pBV220-HLA-A2-BSP和pBV220-β2M原核表达载体的表达高效而且稳定，纯度达90％以上。HPV-18阳性宫颈癌患者体内抗原特异性CTL计数明显高于对照组（P〈0．05）。结论在五聚体复合物的构建中，高效、稳定的pBV220-HLA-A2-BSP和pBV220-β2M原核表达载体是构建成功的基础。所构建的MHC I类分子五聚体和传统的四聚体相比，作为体内、外HPV-18E7抗原特异性CTL检测的有效工具，具有一定优势。