TaqMan荧光定量RT—PCR快速检测西尼罗病毒的研究

目的建立特异、快速、灵敏的TaqMan实时荧光定量聚合酶链反应（TaqMan—based Real—timePCR）用于西尼罗病毒（WNV）核酸检测，为WNV的感染诊断和流行病学监测奠定技术基础。方法根据文献公开发表的WNV核酸检测引物和TaqMan探针，优选最佳引物探针。应用DNAWorks2．4在线软件设计8条寡核苷酸片段，基于PCR合成包含引物探针扩增区域的230个核苷酸作为WNV模拟核酸。并对TaqMan-based Real—timePCR条件进行优化，验证该方法的特异性、灵敏度。结果该方法对WNV核酸检测有高度特异性，与流行性乙型脑炎、登革热1～4型等虫媒病毒均无交叉反应，对构建的DNA检测灵敏度达100拷贝／反应。结论TaqMan—based Real—timePCR是一种快速检测WNV特异、敏感的方法，适用于WNV的早期感染诊断和流行病学监测。     

脐血白细胞介素8因子与生后2年婴幼儿反复喘息的相关性研究

目的探讨脐血细胞因子与生后二年内婴儿反复喘息的相关性。方法抽取200例正常出生的足月新生儿脐血,排除生后出现呼吸窘迫综合症及病理性黄疸的新生儿标本8例,剩余192例脐血检测IL-2、IL-4、IL-6、IL-8、IL-10、IL-1p、IL-12、IL-17水平;新生儿通过电话或者门诊追踪随访观察二年,随访到172例,其中反复喘息婴儿（喘息次数大于等于2次）30例。将上述172例婴儿分为喘息组（30例）及对照组（142例）,两组脐血细胞因子水平比较采用独立样本的r检验进行统计学分析。结果喘息组与非喘息组比较,IL-8有明显升高,差异有显著性（P〈0．05）。而IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、IL—1β、IL-12、IL-17细胞因子水平喘息组与非喘息组比较,差异无显著性（P〉0．05）。结论IL-8可成为生后二年婴幼儿反复喘息的预测因子。     

浙江省传染性非典型肺炎冠状病毒分离株ZJ01的细胞病变与增殖滴度

目的　观察分离自浙江省 1例早期SARS患者的病毒ZJ0 1株在Vero、Vero E6及RD细胞上进行适应 ,以及在上述几种细胞中ZJ0 1株的增殖滴度。方法　病毒增殖采用观察细胞病变及荧光染色法进行。结果　证实ZJ0 1病毒株对Vero、Vero E6及RD等细胞均敏感 ,但在几种细胞中的增殖滴度有较大的差别 ,其中以Vero E6感染滴度最高可达 10 6.0～ 7.0 ,Vero和RD细胞的增殖滴度在 10 3 0～ 4.0 。结论　本文认为SARS病毒ZJ0 1株对上述细胞均敏感 ,其中以Vero E6细胞滴度最高。     

A型呼吸道合胞病毒荧光定量逆转录PCR检测方法的建立与应用

人呼吸道合胞病毒（human respiratory syncytial virus，hRSV）是引起婴幼儿冬春季下呼吸道感染最常见、最重要的病原体之一。根据病毒表面糖蛋白的抗原差异，可分为A、B两型，在我国流行的以A型RSV为主。本实验室在建立RSV逆转录（RT）-PCR检测方法的基础上，利用Taqnmn荧光定量PCR技术，建立了A型RSV荧光定量RT-PCR检测方法，有利于RSV的快速诊断和型别鉴定。     

浙江省义乌市一例输入性登革热的病毒分离及全基因组序列分析

目的调查浙江省义乌市2013年1例输入性登革热病例的分子流行病学特点。方法采集患者血清标本,采用酯酶联免疫吸附试验和实时荧光定量聚合酶链反应分别检测登革病毒IgM抗体和核酸。用C6/36细胞分离病毒和全基因组测序及分析。结果从来自安哥拉的1例登革热患者血清中检测到登革病毒IgM抗体和1型登革病毒核酸,并分离到1株病毒(Zj/yw01)。经序列测定,该病毒基因组全长10 141 bp(GenBank no.KF864667),进化树显示该病毒为登革1型病毒Ⅴ亚型,与安哥拉分离株(KF184957)同源性最高。结论分子生物学证实该病例为来自安哥拉的输入性病例。     

高臭氧紫外线食具消毒柜对脊髓灰质炎病毒灭活效果观察

为观察高臭氧紫外线食具消毒柜对脊髓灰质炎病毒的灭活效果 ,采用载体定量灭活试验进行了检测。结果 ,在环境温度为 2 0～ 2 5℃ ,相对湿度 5 0 %～ 70 %的条件下 ,开机 4min ,柜内紫外线辐照强度为 14 0 0～ 16 0 0 μW/cm2 ,臭氧浓度达到 4 0 .0mg/m3 以上。消毒作用 6 0min +烘干 4 5min对玻片上脊髓灰质炎病毒的平均灭活对数值≥ 4 .0 0。玻片染毒于不同温湿度下 ,干燥对染毒载体的病毒回收滴度有一定影响 ,4℃干燥对病毒回收滴度影响不大 ,使用不干燥的染毒载体进行灭活试验 ,不影响病毒抗力。结果显示 ,该消毒柜能灭活玻片上脊髓灰质炎病毒。     

浙江省近年甲型H1N1流感病毒神经氨酸酶基因序列分析

目的 分析浙江省2009 2013年初甲型H1N1流感病毒神经氨酸酶基因(NA)序列进化特征。 方法 提取浙江省2009 2013年初29株甲型H1N1流感病毒基因组RNA,反转录－聚合酶链反应(RT-PCR)扩增NA基因,测序并拼接出ORF。以浙江省不同年份与地域15份代表性毒株NA序列和GenBank数据库中选取的22株2009 2012年国内外甲型H1N1流感病毒NA基因序列,采用MEGA 5.1软件对其进行序列比对并构建种系发生树。 结果 扩增并测序获得29株甲型H1N1流感病毒的NA基因ORF的全长序列,与国内外甲型H1N1流感病毒NA序列比对后显示序列的同源性较高,浙江省毒株与北美早期甲型H1N1流感病毒典型代表株A/California/04/2009(H1N1)的同源性为98.20％~99.50%,其中采集于2012年末和2013年初的4份病毒NA与A/California/04/2009(H1N1)的同源性为98.63%~99.14%。在1株采集于2010年1月的甲型H1N1流感病毒NA的基因序列中发现可导致奥司他韦耐药的H275Y突变基因型。 结论 虽然浙江省后期的甲型H1N1流感病毒神经氨酸酶基因累积了更多的变异,但所有毒株之间基因同源性仍然较高,所有毒株的神经氨酸酶基因同源性达到98.20％及以上,序列分析结果证实1份毒株携带奥司他韦耐药基因型突变。     

2002年浙江无菌性脑膜脑炎病原学分析

浙江省杭州市和诸暨市2002年5～6月发生病毒性脑膜脑炎流行。我们对两地进行了流行病学调查和标本采集。并进行肠道病毒分离和肠道病毒核酸检测。现将结果报道如下。     

肾综合征出血热Vero传代细胞疫苗的研究

目的研究肾综合征出血热(HFRS)Vero传代细胞疫苗。方法将HFRS双价沙鼠肾细胞灭活疫苗的生产疫苗株Z10(Ⅰ型)、Z37(Ⅱ型)适应到Vero细胞上进行连续传代，并用不同代次的Vero细胞适应株制备Vero传代细胞疫苗。结果Z10、Z37，株感染Vero细胞后第1代即可达到较高病毒滴度，并且在Vero细胞中持续传代适应，病毒滴度分别维持在6．25～6．75和6．50～7．00logTCID50／ml之间，较为稳定。用不同代次的Vero细胞适应株制备而成的HFRS Vero细胞灭活疫苗抗原效价和疫苗的病毒滴度有较大提高，反向间接血凝效价从Z10 Cp1 Vero细胞疫苗的阴性上升到Z10 Cp10 Vero细胞疫苗的1：64，从Z37 Cp1 Vero细胞疫苗的1：2上升到Z37 Cp10 Vero细胞疫苗的1：64；疫苗病毒滴度(logTCID50／ml)从Z10 Cp1 Vero细胞疫苗的4．25上升到Z10 Cp10 Vero细胞疫苗的6．50，从Z37 Cp1 Vero细胞疫苗的6．25上升到Z37 Cp10 Vero细胞疫苗的7．50。疫苗在抗原量和病毒滴度上基本符合中国生物制品的要求。结论HFRS Vero传代细胞疫苗的生产，疫苗株在Vero细胞中的连续传代适应起关键性作用。     

浙江省肠道病毒71型的分离与VP1区域序列分析

目的研究浙江省手足口病患者中肠道病毒（EV）71型分离株的病毒基因特征。方法采集手足口病患者粪便、疱疹液和咽拭子标本，进行病毒分离和逆转录一聚合酶链反应（RT—PCR）特异性扩增进行鉴定，同时选取其中6株EV71分离毒株，对其抗原决定簇部位VP1区进行核苷酸序列测定并参考EV71A、B、C各基因型的参考毒株和以往中国EV71的分离毒株进行同源性分析和构建系统发生树。结果从14份标本中分离出EV9株，经中和试验和RT—PCR特异性扩增，均证实为EV71。其中6株EV71分离毒株与A、B基因型参考毒株的核苷酸和氨基酸同源性分别为82．9％～85．5％和94．9％～98．0％；与C基因型比较，同源性分别为89．2％～94．1％和97．0％～99．0％。而与C基因型的C1、C2、C3、C4亚型代表株的核苷酸同源性分别为91．0％～92．2％、90．2％～90．3％、89．2％～89.5％、96．7％～96．9％，其中与国内以往分离到的C4亚型毒株的核苷酸同源性可达93.8％～97．1％。在系统发生树上，这6株毒株均在C基因型中，与属C4亚型的11株毒株属同一分支。结论浙江省手足口病患者中分离的EV71毒株属C基因型的C4亚型。